La capacità di misurare la cinetica di rilascio delle vescicole può contribuire a fornire indicazioni in alcuni dei principi fondamentali della neurotrasmissione. Qui abbiamo usato imaging in tempo reale delle vescicole etichettati con il colorante rosso fluorescente FM 4-64 per misurare la velocità di rilascio delle vescicole presinaptiche in culture neuronali dell'ippocampo.
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Articolo metodologico
Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di misurare la cinetica di rilascio delle vescicole può contribuire a fornire indicazioni in alcuni dei principi fondamentali della neurotrasmissione. Qui abbiamo usato imaging in tempo reale delle vescicole marcato con FM colorante per monitorare la velocità di rilascio delle vescicole presinaptiche. FM4-64 è un colorante rosso fluorescente anfifilici styryl che incorpora nelle membrane delle vescicole sinaptiche come endocitosi è stimolata. Interazioni lipofile causa del colorante per aumentare notevolmente in fluorescenza, così che emette un segnale luminoso quando associata a vescicole e una nominale quando nel liquido extracellulare. Dopo una fase di lavaggio viene usato per aiutare a rimuovere colorante esterno all'interno della membrana plasmatica, il restante FM è concentrata all'interno del vescicole e poi viene espulso quando esocitosi è indotta da un altro ciclo di stimolazione elettrica. Il tasso di rilascio delle vescicole è misurata dalla conseguente diminuzione della fluorescenza. Dal FM tintura può essere applicata esterni e transitoriamente, è uno strumento utile per determinare i tassi di esocitosi nelle culture neuronali, specialmente quando si confrontano i tassi tra le sinapsi transfettate e boutons controllo limitrofe.
Protocollo
Celle: Rat (o il mouse) colture primarie di neuroni dell'ippocampo (14-28 giorni in vitro).
Stimolazione: elettrica, consegnato tramite due elettrodi di platino; 70-90 mV
Microscopia: lente olio 60x su un microscopio invertito a fluorescenza CCD.
Software: Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Santa Monica, CA)
Vedi supplementare pagina metodi per ulteriori dettagli
- Caldo HEPES soluzione salina tamponata (SPA) a temperatura ambiente. Aggiungere il glutammato antagonisti dei recettori APV (50 microM concentrazione finale) ....
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Discussione
Di 300 potenziali d'azione (AP) è sufficiente per indurre almeno un giro di riciclaggio delle vescicole, uno stimolo di carico di 300 o più punti di accesso è spesso dato per etichettare il riciclo del pool di vescicole. Anche se gli stimoli di carico più intenso, come 900 punti di accesso, può consentire a un numero nominale di vescicole aggiuntivi da etichettare, questo aumenta anche la quantità di tempo che il colorante possibile incorporare nelle membrane extracellulare, portando ad una maggiore colorazione aspecifica. Ho trovato la.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| FM 4-64 | Molecular Probes, Life Technologies | T-3166 | |
| sale disodico di CNQX | Sigma-Aldrich | C-239 |
Riferimenti
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
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Ristampe e permessi
