Articolo metodologico

Homarus Americanus Stomatogastric dissezione del Sistema Nervoso

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DOI:

10.3791/1171

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28 maggio 2009

 , 
1Volen Center for Complex Systems, Brandeis

In questo articolo

Sommario

Descriviamo la dissezione di precisione del sistema nervoso stomatogastric dallo stomaco del aragosta americana ( Homarus americanus).

Abstract

Con l'obiettivo di comprendere come i sistemi nervoso produrre attività e rispondere con l'ambiente, i neuroscienziati rivolgersi a sistemi di modelli che presentano le attività di interesse e sono accessibili e suscettibili di metodi sperimentali. Il sistema nervoso stomatogastric (STNS) della aragosta americana (

Protocollo

Prima di iniziare questo protocollo lo stomaco delle aragoste devono essere rimossi dagli animali e preparato come descritto in questo articolo compagno di Giove (Bierman e Tobin, 2009). La maggior parte dei passaggi descritti di seguito devono essere eseguite al microscopio di dissezione.

Parte I-Isolare i gangli commissurali

  1. Orientare l'antenna in modo che l'estremità anteriore (dal labbro) è lontano da voi e la fine posteriore (per il piloro) è verso di voi.

  2. Assicurarsi che lo stomaco è appuntata in modo che si trova più piatta possibile sul piatto.
    1. Definire con precisione l'esofago su ogni lato del labbro.
    2. Se necessario, riorganizzare gli altri piedini posto durante la dissezione lordo.
  3. Rimuovere il ipoderma.
    1. Afferra il ipoderma vicino al gm2/gm3 muscoli, staccare da questi muscoli e tirare delicatamente nella direzione anteriore.
    2. Separare il ipoderma dal grasso sottostante snipping qualsiasi collegamento. Maggiore uso attenzione intorno l'arteria centrale, che racchiude una parte fondamentale del sistema nervoso stomatogastric. Lasciare l'ipoderma intatto all'interno di un raggio di 0,5 cm del ganglio stomatogastric, che si trova tra i muscoli gm1b.
    3. Tagliare ipoderma separati.
  4. Staccare il cervello dal tessuto sottostante.
    1. Identificare i due nervi grandi commissurali quel progetto bilaterale dalla parte anteriore del cervello ai gangli commissurali nella parte anteriore dello stomaco.
    2. Lasciando questi nervi intatti, sollevare delicatamente il cervello con una pinza e tagliare per separare il cervello dal resto del tessuto. Fare attenzione a come si esegue questa operazione, in quanto il nervo stomatogastric è sotto il cervello e deve essere mantenuta intatta.
  5. Separare i gangli commissurali dal tessuto circostante.
    1. Seguire una commissurali i nervi ad uno dei gangli commissurali.
    2. Identificare lo ione e figlio - questi nervi devono rimanere intatti. Il ganglio commissurali avrà molti nervi che si irradiano. Tagliare la maggior parte di loro (tranne lo ione e figlio), ma lasciare un nervo più attaccato a tenere il ganglio commissurali in posizione mentre finisci la dissezione.
    3. Ripetere con il ganglio altri commissurali.
  6. Pulire lo ione e il figlio da laterale a mediale. Lasciare intatto il nervo labiale per ancorare il sistema nervoso allo stomaco. Il ganglio esofageo si siede erano i s ione si intersecano. È possibile cancellare sotto afferrando il nervo inferiore ventricolare e tirando fino a tagliare sotto.

Parte II-Isolare il ganglio Stomatogastric (STG) e nervi rimanenti.

  1. Separare il STG dal tessuto circostante.
    1. La STG si trova all'interno di una arteria che corre tra i muscoli gm1b e giù per l', gm2a muscoli b. Cercare la fine taglio dell'arteria vicino al gm2a muscoli b.
    2. Tirare l'estremità taglio delle arterie e anteriormente, per esporre la DVN. Continuare a tirare fino a raggiungere il livello del ipoderma rimanenti. Una volta separati, l'arteria può essere tagliato al livello in cui tocca la ipoderma rimanenti.
    3. Tagliare il lembo del muscolo che si trova nella tribuna della aragosta.
    4. Sollevare il ipoderma sopra l'arteria, osservando che l'arteria fa un tunnel dentro il grasso sopra l'STG. Mettere un filo d'vostre forbici dentro l'arteria e tagliare il muscolo sopra di esso. Verificare che si può vedere la DVN come si taglia per essere sicuri di sicuro, oltre le STG. Continuare a tagliare anteriormente, seguendo l'arteria. Come si taglia al di sopra della STG, sarete in grado di vedere la stn emanati anteriormente dal STG e giù per le immersioni nel muscolo. Continuare a tagliare anteriormente a separare completamente il muscolo sopra la STG.
    5. Cancella qualsiasi tessuto lontano dal stn.
  2. Separare il AGN s dal tessuto circostante. (Anche se non avete intenzione di registrare dalla AGN, avrete bisogno di una porzione del nervo intatto da definire il ganglio per le registrazioni intracellulari.)
    1. Per meglio vedere la s AGN, rimuovere il ipoderma rimanente e un sottile strato del muscolo sottostante.
    2. Appena posteriore al STG, individuare un tunnel buio nel grasso e nel muscolo su entrambi i lati della DVN.
    3. Stick una lama forbice all'interno del tunnel e tagliare il tessuto sopra il nervo. Continuare a tagliare lateralmente, seguendo il nervo, di isolarla. (Un paio di millimetri è sufficiente per appuntare il ganglio, ma esporre almeno 5 mm del AGN se si prevede di registrare da esso.)
    4. Staccare il AGN dal muscolo che innerva tagliando i collegamenti.
    5. Ripetere sull'altro lato per isolare il AGN altri.
    6. Una volta che entrambi agn s sono stati sezionati, tagliati tutti i muscoli e tessuto connettivo della STG allo stomaco.
  3. Isolare la s. mvn Si tratta di una coppia bilaterale dei nervi che si diramano le piccole e LVN attraversando lateralmente sotto il grasso.
    1. Utilizzare due pinze o forbici per tagliare il grasso da una parte della DVN, vicino a dove si dirama in due LVN s. Qui sono ben lungi dall'essere la s mvn e non rischio di taglio loro.
    2. Sollevare lo strato di grasso, e identificare le sotto mvn piccolo. Questi nervi eseguire mediale lateralmente appena posteriormente al livello dei muscoli gm1b.
    3. Rimuovere lo strato di grasso sopra il mvn, lasciando intatto il nervo per ora in modo da non impigliarsi. Che si dividerà la sua fine laterale da fuori lo stomaco alla fine della dissezione.
    4. Ripetere la procedura sul lato opposto per isolare il mvn altri.
  4. Isolare la LVN s ei nervi posteriori.
    1. Partenza in cui il ramo LVN s lateralmente al largo della DVN, seguono un LVN tagliando il grasso sopra di esso. A seconda della preparazione, a volte l'intero livello di grasso sopra il nervo può essere tirato fuori.
    2. Continua rivelando il LVN fino al punto in cui i rami psn off.
  5. Isolare la pyn.
    1. Individuare il pyn, è un nervo viaggio posteriormente oltre il piloro.
    2. Rimuovere la sottile membrana che copre questa regione.
    3. Isolare l'pyn tagliando una piccola sezione del piloro, allegata al pyn.
    4. Sollevare delicatamente la sezione del piloro e tagliare il tessuto su entrambi i lati della pyn fino a raggiungere il ramo che si collega al PDN.
  6. Isolare il PDN.
    1. Individuare il PDN, è un nervo viaggio posteriormente al muscolo dilatatore pilorica.
    2. Tagliare una piccola sezione del muscolo dilatatore pilorica, presso il PDN.
    3. Sollevare delicatamente il piloro sezione muscolo dilatatore, tagliare il tessuto su entrambi i lati del PDN fino a raggiungere il ramo che si collega al pyn.
  7. Isolare il LVN ventrale, che collega la pyn e PDN al LVN.
    1. Al punto di diramazione triangolare dove la pyn e PDN connettersi al LVN ventrale, isolare qualsiasi piccola sezione del nervo che si dirama dalla LVN ventrale, come il vpln. Questo sarà usato come una maniglia per tirare il LVN ventrale.
    2. Sollevare la maniglia e tagliare il tessuto su entrambi i lati della LVN ventrale, lavorando nella direzione anteriore fino a raggiungere il punto in cui i rami psn off.
  8. Ripetere i passaggi 10 - 13 a isolare i nervi LVN e posteriore sul lato opposto.

  9. Staccare il sistema nervoso stomatogastric dallo stomaco.
    1. Per staccare completamente la LVN dallo stomaco, tirare il PSN e tagliare tutti i tessuti ed i nervi attaccato al LVN e LVN ventrale, ad eccezione del PDN e pyn. Ripetere questa operazione sull'altro lato.
    2. Tagliare l'estremità laterale di ogni mvn. Sollevare l'estremità laterali e tagliare gli eventuali allegati estranei tra il nervo ed il tessuto dello stomaco sottostante.
    3. Alla fine anteriore, tagliare gli allegati estraneo ai gangli commissurali, e tagliare il nervo labiale su ogni lato.
    4. Visivamente la scansione del sistema stomatogastric sistema nervoso per identificare e poi tagliare gli eventuali allegati aggiuntivi al tessuto dello stomaco.
    5. Afferrare l'estremità anteriore di entrambi i nervi commissurali, sopra i gangli commissurali, e la buccia del sistema nervoso stomatogastric fuori dello stomaco e passare al lato del piatto. Come si esegue questa operazione, tagliare tutti gli allegati rimanente per liberare il sistema nervoso.
  10. Preparare il piatto piccolo Sylgard.
    1. Strofinare alcuni tessuti dello stomaco a fondo sulla superficie del Sylgard nel piatto di piccole dimensioni. Questo diminuirà la idrofobicità del Sylgard, in modo che salino distribuirà in modo uniforme in tutto il piatto.
    2. Sciacquare e riempire il piatto Sylgard con soluzione fisiologica fredda.
  11. Trasferire il sistema nervoso per il piatto preparato Sylgard afferrando l'estremità anteriore di entrambi i nervi commissurali, sollevando il sistema nervoso fuori dal piatto di grandi dimensioni, e che ha nel piatto di piccole dimensioni.

  12. Perno del STNS nel piatto piccolo utilizzando una combinazione di pin minuten e più sottile perni tagliati dal filo di tungsteno.
    1. Garantire che la preparazione è parte dorsale fino controllando che il nervo ventricolare inferiore è rivolta in direzione opposta alla Sylgard.
    2. Togliere il cervello ed i nervi commissurali pin.
    3. Tirare delicatamente il sistema nervoso stretto e piatto tirando ciascuna delle s psn posteriormente e lateralmente, ed unendoli in giù.
    4. Rimuovere il muscolo pilorico dilatatore dalla s PDN e il perno s. PDN
    5. Rimuovere ilsegmento pilorica dalla s pyn, e appuntare s. pyn
    6. Definire con precisione ogni nervi rimasti isolati come i nervi labiale, il mvn s e AGN s.
  13. Desheath la STG.
    1. Assicurarsi che la STG è piatto contro la Sylgard e messa in tensione da laterale AGN s, la stn anteriore e il posteriore DVN.
    2. Disporre l'illuminazione per permettere la visualizzazione degli assoni all'interno della DVN.
    3. Usando un piccolo spillo o un ago di tungsteno fine, fare un piccolo foro poco profondo nella guaina che circonda la DVN, appena posteriore al STG.
    4. Tirare l'ago attraverso la DVN, dorsale per gli assoni, per creare uno strappo orizzontale nella guaina del nervo.
    5. Afferra il lembo della guaina del nervo posteriore alla STG anteriormente e tirare per rimuovere la guaina dal lato dorsale del STG.
Abbreviazioni:
STNS Stomatogastric sistema nervoso
STG Ganglio Stomatogastric
CoG Ganglio commissurali
stn nervo stomatogastric
mvn ventricolare nervo mediale
ione esofageo inferiore del nervo
figlio superiore del nervo esofageo
AGN anteriore del nervo gastrico
DVN ventricolare nervo dorsale
LVN ventricolare nervo laterale
PSN stomaco nervo posteriore
vpln ventrale del nervo laterale posteriore
pyn nervo pilorica
PDN dilatatore nervo pilorica

Discussione

L'anatomia dello stomaco aragosta e STNS è stata ben descritta in precedenza 5,6, e le variazioni di questa procedura dissezione sono state utilizzate in numerosi studi. Si consiglia di acquisire familiarità con l'anatomia dello stomaco 5-7 e STNS 5,8 prima di dissezioni all'inizio. Tale familiarità diminuisce il rischio di danni accidentali ai nervi e tessuti.

Per mantenere la salute della preparazione, è fondamentale per mantenere la preparazione a temperatura fresca. Questo è facilmente ottenibile scambiando le saline ogni 30 minuti con 4 ˚ C salina conservato in frigorifero. Quando immerso in soluzione fisiologica fredda, la preparazione isolato STNS è vitale per molte ore. Registrazioni nei relativi gammarus Homarus hanno dimostrato stabile attività ritmica dalla STG tutto 5 giorni in vitro 9; robustezza simile è stato visto in H. americanus (pers. obs.).

Ingresso di modulazione alla STG dai gangli commissurali è tenuto a conservare gli schemi motori in corso. Pertanto, per mantenere una normale attività ritmica questi gangli e il figlio di ioni e nervi stn deve essere mantenuta intatta. La dissezione descriviamo conserva nervi motori diversi (contenente gli assoni dei motoneuroni): il s AGN (contenente Mulino gastrica (GM) assoni), il mvn s (contenente gastrica laterale (LG) e Inferiore cardiaca (IC) assoni), il pyn s (contenente pilorica neurone (PY) assoni), la s PDN (contenente dilatatore pilorica (PD) assoni), e la s LVN (contenente pilorica laterale (LP), gastrica mediale (MG), gli assoni GPL così come quelli di GM, PD e PY). Da dissezione aggiuntivi (o diverso) i nervi, gli altri gli assoni dei neuroni motori possono essere registrate. Ogni singola tipologia di assoni dei motoneuroni possono essere registrate individualmente da dissezione e la registrazione dal nervose che innervano il muscolo a cui quel tipo di progetti neurone.

Questa preparazione può essere utilizzato per una varietà di studi si sono concentrati sulla funzione del sistema nervoso. L'attività dei neuroni può essere registrata usando intracellulare, registrazioni elettrodo affilato da somata o assoni, o registrando impulsi elettrici extracellulare dai nervi. Molti canali ionici nei neuroni STG sono state parzialmente clonato e mRNA può essere misurata dal manualmente tirato somata 10,11.

Ringraziamenti

Vogliamo ringraziare il nostro consulente, il dottor Eve Marder. Questa ricerca è stata finanziata dal National Institute of concede Salute NS17813 a Eve Marder e NS059255 di AE T.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filo fine in tungsteno (diametro 0,001 in)StrumentoCalifornia Fine Wire CompanyTagliare in pezzi da 1-2 mm da utilizzare come minutini fini.
Pinzette #5StrumentoFine Science Tools91150-20
MinutiniStrumentoFine Science Tools26002-10
Forbici a molla Moria (lame da 7 mm)StrumentoFine Science Tools15370-52Queste sono le migliori disponibili. La stessa azienda offre modelli più economici di forbici a molla.
Piatto di Petri (100x15 mm)StrumentoFisher Scientific08-757-12Riempire con 2-4 mm di Sylgard 182.
Sylgard 182AltroDow Corning182
PortaminutiniStrumentoFine Science Tools26018-17Facoltativo. La dissezione della guaina può essere eseguita solo con forbici e pinzette fini.
Pinzette finissime #5SFStrumentoFine Science Tools11252-00
Aghi in tungstenoStrumentoFine Science Tools10130-05Facoltativo. La dissezione della guaina può essere eseguita con forbici o con minutini ricavati da filo fine in tungsteno.
Microscopio per dissezione

Riferimenti

  1. Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).
  2. Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature. 417, 343-350 (2002).
  3. Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen. J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).
  4. Bierman, H. S., Tobin, A. E. Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus. J Vis Exp. 27, (2009).
  5. Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).
  6. Herrick, F. H. Natural history of the American lobster. Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).
  7. Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
  8. Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion. J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).
  9. Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture. J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).
  10. Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals. Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).
  11. Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).

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