Descriviamo un semplice protocollo per identificare le proteine del cervello che si legano al capolinea pieno C lunghezza di ATP-dipendenti P2X2 recettori. L'estensione e l'applicazione sistematica di questo approccio a tutti i recettori P2X dovrebbe portare ad una migliore comprensione di segnalazione dei recettori P2X.
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Articolo metodologico
Proteomica per identificare proteine che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ligando-canali ionici alla base della comunicazione sinaptica nel sistema nervoso 1. Nei mammiferi ci sono tre famiglie di canali ligando-dipendenti: il ciclo Cys, il glutammato-dipendenti ed i canali recettori P2X 2. In ogni caso vincolante del trasmettitore porta alla apertura di un poro attraverso il quale gli ioni scendono i loro gradienti elettrochimici. Molti canali ligando-dipendenti sono permeabili agli ioni calcio 3, 4, che hanno ruoli di segnalazione a valle 5 (regolazione dei geni ad esempio) che possono superare la durata di apertura del canale. Così ligando-dipendenti canali in grado di segnalare su scale temporali di ampia portata da pochi millisecondi a giorni. Alla luce di questi importanti ruoli, è necessario capire come ligando-canali ionici si sono regolati da proteine, e come queste proteine possono regolare segnalazione. Studi recenti suggeriscono che molti, se non tutti, i canali possono far parte di complessi proteina di segnalazione 6. In questo articolo spiegheremo come identificare le proteine che si legano al C-terminale aspetti del settore P2X2 recettore citosolico.
Recettori P2X sono ATP-dipendenti canali di comunicazione e composto da sette subunità (P2X1-P2X7). Recettori P2X sono ampiamente espresse nel cervello, dove mediano la trasmissione sinaptica eccitatoria e facilitazione presinaptica di neurotrasmettitori versione 7. Recettori P2X si trovano nelle cellule eccitabili e non eccitabili e mediare ruoli chiave nella segnalazione neuronale, l'infiammazione e la funzione cardiovascolare 8. P2X2 recettori sono abbondanti nel sistema nervoso 9 e sono al centro di questo studio. Ogni subunità P2X è pensato di possedere due segmenti di membrana spanning (TM1 e TM2) separate da una regione extracellulare 7 e intracellulare N e C Termini (Fig. 1a) 7. Subunità P2X 10 (P2X1-P2X7) mostrano omologia di sequenza del 30-50% a livello di aminoacidi 11. Recettori P2X contengono solo tre subunità, che è il più semplice stechiometria tra recettori ionotropici. Il P2X2 C-terminale è composta da 120 aminoacidi (Fig. 1b) e contiene numerose proteine siti consenso docking, supportando l'ipotesi che P2X2 recettore può essere parte di complessi di segnalazione. Tuttavia, anche se diverse funzioni sono state attribuite al C-terminale del recettore P2X2 9 nessuno studio ha descritto i partner molecolari che paio al lato di questa proteina intracellulare attraverso tutta la lunghezza C-terminale. In questo documento si descrivono i metodi di un approccio di proteomica per identificare le proteine che interagiscono con l'intera lunghezza C-terminale del recettore P2X2.
Protocollo
Procedure sperimentali
La procedura sperimentale (Fig. 2) si compone di quattro parti che sono descritti in un modo graduale di seguito.
Parte 1: subcloning ed espressione del C-terminale del recettore P2X2.
Abbiamo espresso tutta la lunghezza C-terminale del recettore P2X2 nei batteri per identificare le proteine del cervello a cui si lega.
- Il C-terminale (residui 353-472) del recettore P2X2 (Fig. 1) è stato amplificato mediante PCR, clonati in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) e verificato con il sequenziamento.
- Il plasmide ricombinante è stato trasformato in ....
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Discussione
Canali ionici sono una classe importante di proteine integrali di membrana. Essi contengono pori riempiti d'acqua che selettivamente permettono il movimento degli ioni i loro gradienti elettrochimici attraverso la membrana plasmatica. Ion cancello canali tra gli stati aperti e chiusi. Il passo gating è innescato da trasmettitori (es. ATP) in caso di P2X canali ionici ligando gated, o può essere regolata da interazioni con altre proteine. L'ultimo decennio ha visto un aumento della nostra comprensione di come i.......
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Ringraziamenti
SW e TMV sono supportati dal NCRR e NHLBI presso il National Institutes of Health. BSK e HS sono supportati dal NINDS e NIGMS del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Reagente | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagente | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicillina | Reagente | VWR international | VW1507-01 | |
| Bicarbonato di ammonio | Reagente | Fluka | 09830 | |
| Peroxidisolfato di ammonio (APS) | Reagente | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosina trifosfato (ATP) | Reagente | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| reagente di Bradford | Reagente | Bio-Rad | 500-0006 | |
| blu di bromofenolo | Reagente | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blu R-250 | Reagente | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Ditiotreitolo (DTT) | Reagente | EMD Millipore | 3860 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Reagente | VWR international | VW1474-01 | |
| Acido etilenglicole tetraacetico (EGTA) | Reagente | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Acido formico | Reagente | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Beads di Glutatione Sepharose 4B | Reagente | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Acido cloridrico (HCl) | Reagente | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG) | Reagente | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagente | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Mezzi Luria-Bertani (LB) | Reagente | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptina | Reagente | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lisozima | Reagente | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Solfato di magnesio (MgSO₄)4) | Reagente | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Reagente | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Fluoruro di sodio (NaF) | Reagente | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodio ortovanadato (Na3VO4) | Reagente | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagente | Fluka | 74385 | |
| Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF) | Reagente | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Compresse di inibitore delle proteasi | Reagente | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Standard proteico | Reagente | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagente | Acros Organics | 61207 | |
| Vial con tappo a vite | Strumento | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Dodecilsolfato di sodio | Reagente | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Colorante proteico per gel Ruby | Reagente | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,’-Tetrametiletilendiammina (TEMED) | Reagente | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Reagente | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagente | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tripsina | Reagente | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagente | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Acqua | Reagente | Burdick &e Jackson | 365-4 | |
| Spettrometro di massa tandem LTQ-Orbitrap | Strumento | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sistema di cromatografia liquida nano | Strumento | Eksigent | ||
| B-Mercapt–etanolo | Reagente | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glicerolo | EMD Millipore | GX0185-6 |
Riferimenti
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contr....
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Ristampe e permessi
