Derivazione di precursori neuroepiteliale da staminali embrionali (ES), le cellule stromali utilizzando cellule derivate attività induttiva (SDIA).
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Articolo metodologico
ES Cell-derivati colture cellulari neuroepiteliale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali hanno la potenzialità di differenziarsi in cellule di tutti i foglietti embrionali, che li rende uno strumento interessante per lo sviluppo di nuove terapie. In generale, la differenziazione delle cellule staminali embrionali segue il concetto di generare prime cellule progenitrici immature, che poi possono essere propagate e differenziato in maturo fenotipi cellulari. Ciò vale anche per ES derivati dalle cellule neurogenesi, in cui lo sviluppo delle cellule neurali segue due fasi principali: in primo luogo, la derivazione e l'espansione di precursori immaturi neuroepiteliale e la seconda, la loro differenziazione in cellule nervose mature. Un metodo comune per la produzione di progenitori neurali da cellule staminali embrionali è basato sul corpo (EB) la formazione, che rivela la differenziazione delle cellule germinali da tutti i livelli compresi neuroectoderma. Un metodo alternativo e più efficiente per indurre lo sviluppo neuroepiteliale cella utilizza cellule stromali derivate attività induttiva (SDIA), che può essere raggiunto da co-colture di cellule ES con l'osso del cranio derivate dal midollo cellule stromali (1). Entrambi, formazione EB e SDIA, rivelano lo sviluppo di rosetta-come le strutture, che si pensa ad assomigliare a tubo neurale e / o cresta neurale, come progenitori. I precursori neurali possono essere isolati, ampliato e ulteriormente differenziate in neuroni e cellule gliali specifici utilizzando condizioni di coltura definiti. Qui, descriviamo la generazione e l'isolamento di queste rosette in co-coltura esperimenti con la linea di cellule stromali MS5 (2-5).
Protocollo
Fase 1
- Piastra mitomicina-C ggrowth inibito (10 mg / ml per 2,5 ore) MS5 cellule ad una densità di 70.000 / cm2 di gelatina rivestita (0,01% per 30 minuti) 6 piastre in α-MEM media.
- Quando le cellule sono collegate e hanno formato un monostrato (oltre crescita notte), passare a SRM.
- Manualmente isolare colonie di cellule ES da colture di cellule ES usando una siringa con un ago 27 ½ G.
- Tritrurate le colonie accuratamente con una punta di 1 ml di blu e la piastra a bassa densità sul MS5 cellule (di solito 2-3 colonie per 6 pozzetti).
Nota: Le cellule ES possono anche essere prelevati da pro....
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Discussione
Questo protocollo mostra le diverse fasi di generazione e isolare le cellule neuroepiteliale da cellule staminali embrionali umane usando SDIA. L'applicazione di questo metodo è molteplice ed è stato utilizzato in molti protocolli di produrre neuroni specificato (ad esempio 1, 2, 5-9). Le rosette sono pensati per assomigliare a cellule del tubo neurale con un fenotipo anteriore (2, 5, 10) e contengono anche progenitori della cresta neurale (11, 12). Inoltre, essi mantengono un certo grado di plasticità, in quanto possono essere modellat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| L-Glutammina | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Penicillina/streptomicina | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Sostituto del siero Knockout | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| Integratore N2-A | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomicina-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gelatina tipo A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poli-L-ornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | soluzione allo 0,01% | |
| Laminina | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Fattore di crescita dei fibroblasti basico (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| Siringa da 1 mL con ago da 27 1/2 G | BD Biosciences | 309623 | ||
| Mezzo N2-A | mezzo | DMEM/F12 + 1% integratore N2-A | ||
| Mezzo con sostituto del siero (SRM) | mezzo | Knockout-DMEM + 20% sostituto del siero Knockout + 1% soluzione di aminoacidi non essenziali MEM + 2 mM L-glutammina | ||
| Mezzo α-MEM | mezzo | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutammina + 1% penicillina/streptomicina | ||
| MS5 | linea cellulare | cellule stromali | ||
| Microscopio | ||||
| Piastre a 6 pozzetti | per colture cellulari |
Riferimenti
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Perrier, A. L., et al. Derivation....
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Ristampe e permessi
