Articolo metodologico

ES Cell-derivati ​​colture cellulari neuroepiteliale

DOI:

10.3791/118

⸱

30 novembre 2006

 ,  ,  , 
1McLean Hospital, Harvard Medical School

In questo articolo

Sommario

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Derivazione di precursori neuroepiteliale da staminali embrionali (ES), le cellule stromali utilizzando cellule derivate attività induttiva (SDIA).

Abstract

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Le cellule staminali hanno la potenzialità di differenziarsi in cellule di tutti i foglietti embrionali, che li rende uno strumento interessante per lo sviluppo di nuove terapie. In generale, la differenziazione delle cellule staminali embrionali segue il concetto di generare prime cellule progenitrici immature, che poi possono essere propagate e differenziato in maturo fenotipi cellulari. Ciò vale anche per ES derivati ​​dalle cellule neurogenesi, in cui lo sviluppo delle cellule neurali segue due fasi principali: in primo luogo, la derivazione e l'espansione di precursori immaturi neuroepiteliale e la seconda, la loro differenziazione in cellule nervose mature. Un metodo comune per la produzione di progenitori neurali da cellule staminali embrionali è basato sul corpo (EB) la formazione, che rivela la differenziazione delle cellule germinali da tutti i livelli compresi neuroectoderma. Un metodo alternativo e più efficiente per indurre lo sviluppo neuroepiteliale cella utilizza cellule stromali derivate attività induttiva (SDIA), che può essere raggiunto da co-colture di cellule ES con l'osso del cranio derivate dal midollo cellule stromali (1). Entrambi, formazione EB e SDIA, rivelano lo sviluppo di rosetta-come le strutture, che si pensa ad assomigliare a tubo neurale e / o cresta neurale, come progenitori. I precursori neurali possono essere isolati, ampliato e ulteriormente differenziate in neuroni e cellule gliali specifici utilizzando condizioni di coltura definiti. Qui, descriviamo la generazione e l'isolamento di queste rosette in co-coltura esperimenti con la linea di cellule stromali MS5 (2-5).

Protocollo

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Fase 1

  1. Piastra mitomicina-C ggrowth inibito (10 mg / ml per 2,5 ore) MS5 cellule ad una densità di 70.000 / cm2 di gelatina rivestita (0,01% per 30 minuti) 6 piastre in α-MEM media.
  2. Quando le cellule sono collegate e hanno formato un monostrato (oltre crescita notte), passare a SRM.
  3. Manualmente isolare colonie di cellule ES da colture di cellule ES usando una siringa con un ago 27 ½ G.
  4. Tritrurate le colonie accuratamente con una punta di 1 ml di blu e la piastra a bassa densità sul MS5 cellule (di solito 2-3 colonie per 6 pozzetti).

Nota: Le cellule ES possono anche essere prelevati da propagazione enzimatica con collagenasi e tripsina.

Fase 2

  1. Crescere le cellule ES sul MS5 alimentatori per 14-21 giorni fino a rosetta contenenti formano colonie.


Nota: i media cambiano spesso. Le rosette sono di solito ai bordi esterni delle colonie e la loro formazione può essere notevolmente migliorata se 300-500 ng / ml Noggin viene aggiunto al SRM (3). In alcuni protocolli di differenziazione, SRM possono essere scambiati con N2-A media e integrata con altri fattori di crescita o di promuovere specifiche cellule (2-5).

Fase 3

  1. Isolare e scegliere le rosette con un 27 ½ ago G al microscopio.

Nota: Evitare di tagliare e scegliere i MS5 cellule stromali. Se le colonie sono pieni di rosette, si può anche isolare l'intera colonia.


Fase 4

  1. Aspirare il cluster di rosette, li tritrurate accuratamente con una punta di 1 ml blu, e la piastra li poli-L-ornitina (0,001%) e fibronectina (1 mg / ml) o laminina (1 mg / ml) rivestita 6 pozzi in N2-Una media di solito integrati con bFGF (20 ng / ml). Le rosette si riforma e si espandono.

Nota: per migliorare la sopravvivenza delle cellule, si possono piatto i cluster di piccole gocce di aumentare la densità delle cellule. Questa fase può anche essere modificata, che completa l'N2-A media con un'ulteriore crescita o altri fattori di promuovere la specificazione delle cellule (2-5).

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Discussione

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Questo protocollo mostra le diverse fasi di generazione e isolare le cellule neuroepiteliale da cellule staminali embrionali umane usando SDIA. L'applicazione di questo metodo è molteplice ed è stato utilizzato in molti protocolli di produrre neuroni specificato (ad esempio 1, 2, 5-9). Le rosette sono pensati per assomigliare a cellule del tubo neurale con un fenotipo anteriore (2, 5, 10) e contengono anche progenitori della cresta neurale (11, 12). Inoltre, essi mantengono un certo grado di plasticità, in quanto possono essere modellat...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
L-GlutamminaGIBCO, by Life Technologies25030
alpha-MEMGIBCO, by Life Technologies12571
Penicillina/streptomicinaGIBCO, by Life Technologies15140
Knockout-DMEMGIBCO, by Life Technologies10829
Sostituto del siero KnockoutGIBCO, by Life Technologies10828
Soluzione di aminoacidi non essenziali MEMGIBCO, by Life Technologies12383
DMEM/F12GIBCO, by Life Technologies11330
Integratore N2-AStem Cell Technologies07152
Mitomicina-CSigma-AldrichM0503
Gelatina tipo ASigma-AldrichG1890
poli-L-ornitinaSigma-AldrichP4957soluzione allo 0,01%
LamininaSigma-AldrichL-2020
FibronectinaSigma-AldrichF2006
Fattore di crescita dei fibroblasti basico (bFGF)Invitrogen13256
Siringa da 1 mL con ago da 27 1/2 GBD Biosciences309623
Mezzo N2-AmezzoDMEM/F12 + 1% integratore N2-A
Mezzo con sostituto del siero (SRM)mezzoKnockout-DMEM + 20% sostituto del siero Knockout + 1% soluzione di aminoacidi non essenziali MEM + 2 mM L-glutammina
Mezzo α-MEMmezzoα-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutammina + 1% penicillina/streptomicina
MS5linea cellularecellule stromali
Microscopio
Piastre a 6 pozzettiper colture cellulari

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
  6. Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
  7. Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
  8. Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
  9. Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
  10. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  11. Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
  12. Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).

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Differenziamento di cellule EScellule neuroepitelialiformazione di corpi embrioidiattivit induttiva derivata da cellule stromalistrutture simili a rosetteisolamento di progenitori neuraliesperimenti di co colturacellule stromali MS5progenitori del tubo neuraleprogenitori della cresta neurale

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