L'elaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray

Summary

Il cDNA microarray PtGen2 stato sviluppato per studi di espressione genica in pino loblolly, P. taeda, E altre specie di conifere. Qui mostriamo pre-e post-ibridazione manipolazione e il lavaggio delle tecniche che possono essere utilizzati con questo array per produrre una maggiore coerenza, manufatti ridotti e inferiori sfondi.

Abstract

PtGen2 è una caratteristica del DNA microarray 26.496 contenente amplificato EST pino loblolly. La serie è prodotta nel nostro laboratorio per l'utilizzo da parte di ricercatori studiando l'espressione genica in specie di pino ed altre conifere. PtGen2 è stato sviluppato come risultato degli sforzi gene nostra scoperta in pino loblolly, ed è composto da sequenze identificate principalmente dai tessuti radice, ma anche da ago e staminali. ^1,2 PtGen2 è stato testato da ibridare differenti Cy-dye etichettati cDNA bersaglio di conifere , utilizzando sia amplificato e non amplificati modalità di etichettatura indiretti, e anche testato con una serie di condizioni di ibridazione e di lavaggio. Questo video si concentra sulla gestione e l'elaborazione di diapositive prima e dopo la pre-ibridazione, così come dopo ibridazione, con alcune modifiche alle procedure sviluppate in precedenza. ^3,4 inclusi anche, in forma di testo unico, sono i protocolli utilizzati per la generazione, l'etichettatura e la pulizia di s cDNA bersaglio, così come informazioni sul software utilizzato per l'elaborazione dei dati a valle.

PtGen2 è stampato con un buffer di stampa proprietario che contiene alte concentrazioni di sale che possono essere difficili da rimuovere completamente. I vetrini vengono lavati prima di una soluzione calda SDS prima di pre-ibridazione. Dopo la pre-ibridazione, le diapositive vengono lavati con vigore in diversi cambiamenti di acqua per completare la rimozione dei sali rimanenti. LifterSlips ™ sono quindi puliti e posizionati sul diapositive e cDNA marcato è attentamente caricati sul microarray per mezzo di un'azione capillare che prevede anche la distribuzione del campione lungo la diapositiva e riduce la possibilità di incorporazione bolla. Ibridazione degli obiettivi alla matrice avviene a 48 ° C in condizioni di elevata umidità. Dopo l'ibridazione, una serie di lavaggi standard sono fatto a 53 ° C e temperatura ambiente per tempi prolungati. Elaborazione PtGen2 diapositive utilizzando questa tecnica riduce sale e SDS-derivati ​​artefatti spesso visto quando l'array è un'elaborazione meno rigorosamente. Ibridazione obiettivi derivanti da diverse fonti diverse conifere RNA, questo protocollo di elaborazione prodotto un minor numero di artefatti, sfondo ridotto, e ha fornito una migliore coerenza tra i diversi gruppi sperimentali di array.

Protocol

(Nota sezioni 1 - 4 Non dimostrato in video)

Preparazione Cy-etichetta target cDNA

Quello che segue è il protocollo che usiamo per la sintesi di cDNA da RNA pino loblolly totale e indiretta etichettatura cDNA microarray prima di ibridazioni. Anche se pochi, non banali sono state apportate modifiche, il protocollo sottostante è simile a quello nel manuale di istruzioni fornito con il kit SuperScript Invitrogen indiretta Etichettatura cDNA.

Parte 1: Prima Strand reazione di sintesi del DNA

1. Mescolare e girare brevemente ogni componente del kit prima dell'uso.
2. Prepar....

Discussion

PtGen2 è sviluppata di recente, cDNA microarray personalizzati che è stato progettato per essere utilizzato principalmente dalla comunità di ricerca loblolly pino. I risultati preliminari generato finora hanno mostrato l'array di essere un valido strumento nella valutazione degli eventi trascrizionale che si verificano in risposta a stress idrico, così come nel monitoraggio dei cambiamenti che si verificano durante lo sviluppo embrionale in pino marittimo, Pinus pinaster ^5,6 Abbiamo inoltre recen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampone			di pre-ibridazione	5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA
Tampone				30% formammide, 5X SSC, 5X Denhardt' s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA. GF), 0,1% SDS
Soluzione di lavaggio #1	Buffer			1X SSC, 0,2% SDS, preriscaldare a 43° Soluzione
di lavaggio C #2	Tampone			0,1X SSC, 0,2% Soluzione di lavaggio SDS
#3	Tampone			0,1X SSC
Reagente alcol isopropilico		Sigma-Aldrich	34959-2,5L
Provette coniche da 50 ml	Altro	Falcon BD	352070
Provette coniche da 15 ml	Altro	Falcon BD	352196	Utilizzare questo o un tappo simile posizionato sul fondo di ciascuna provetta conica da 50 ml durante la centrifugazione
Barattolo		Coplin Wheaton	900520
Piatto di colorazione e Rack	Altro	Wheaton	900200
Albumina da siero bovino (BSA)	Altro	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA.
SuperScriptTM Kit di marcatura indiretta del cDNA		Invitrogen	L1014-02
Kit Turbo DNase		Ambion	AM1907
Sistema
Cy-5	Reagente	GE Healthcare	PA25001
Reagente colorante Cy-3		GE Healthcare	PA23001
LifterSlitte™	Altre	Erie Scientific	25X601
HybChambers		GeneMachines	JHYB200003