Il cDNA microarray PtGen2 stato sviluppato per studi di espressione genica in pino loblolly, P. taeda, E altre specie di conifere. Qui mostriamo pre-e post-ibridazione manipolazione e il lavaggio delle tecniche che possono essere utilizzati con questo array per produrre una maggiore coerenza, manufatti ridotti e inferiori sfondi.
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Articolo metodologico
L'elaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray
In questo articolo
Sommario
Abstract
PtGen2 è una caratteristica del DNA microarray 26.496 contenente amplificato EST pino loblolly. La serie è prodotta nel nostro laboratorio per l'utilizzo da parte di ricercatori studiando l'espressione genica in specie di pino ed altre conifere. PtGen2 è stato sviluppato come risultato degli sforzi gene nostra scoperta in pino loblolly, ed è composto da sequenze identificate principalmente dai tessuti radice, ma anche da ago e staminali. 1,2 PtGen2 è stato testato da ibridare differenti Cy-dye etichettati cDNA bersaglio di conifere , utilizzando sia amplificato e non amplificati modalità di etichettatura indiretti, e anche testato con una serie di condizioni di ibridazione e di lavaggio. Questo video si concentra sulla gestione e l'elaborazione di diapositive prima e dopo la pre-ibridazione, così come dopo ibridazione, con alcune modifiche alle procedure sviluppate in precedenza. 3,4 inclusi anche, in forma di testo unico, sono i protocolli utilizzati per la generazione, l'etichettatura e la pulizia di s cDNA bersaglio, così come informazioni sul software utilizzato per l'elaborazione dei dati a valle.
PtGen2 è stampato con un buffer di stampa proprietario che contiene alte concentrazioni di sale che possono essere difficili da rimuovere completamente. I vetrini vengono lavati prima di una soluzione calda SDS prima di pre-ibridazione. Dopo la pre-ibridazione, le diapositive vengono lavati con vigore in diversi cambiamenti di acqua per completare la rimozione dei sali rimanenti. LifterSlips ™ sono quindi puliti e posizionati sul diapositive e cDNA marcato è attentamente caricati sul microarray per mezzo di un'azione capillare che prevede anche la distribuzione del campione lungo la diapositiva e riduce la possibilità di incorporazione bolla. Ibridazione degli obiettivi alla matrice avviene a 48 ° C in condizioni di elevata umidità. Dopo l'ibridazione, una serie di lavaggi standard sono fatto a 53 ° C e temperatura ambiente per tempi prolungati. Elaborazione PtGen2 diapositive utilizzando questa tecnica riduce sale e SDS-derivati artefatti spesso visto quando l'array è un'elaborazione meno rigorosamente. Ibridazione obiettivi derivanti da diverse fonti diverse conifere RNA, questo protocollo di elaborazione prodotto un minor numero di artefatti, sfondo ridotto, e ha fornito una migliore coerenza tra i diversi gruppi sperimentali di array.
Protocollo
(Nota sezioni 1 - 4 Non dimostrato in video)
Preparazione Cy-etichetta target cDNA
Quello che segue è il protocollo che usiamo per la sintesi di cDNA da RNA pino loblolly totale e indiretta etichettatura cDNA microarray prima di ibridazioni. Anche se pochi, non banali sono state apportate modifiche, il protocollo sottostante è simile a quello nel manuale di istruzioni fornito con il kit SuperScript Invitrogen indiretta Etichettatura cDNA.
Parte 1: Prima Strand reazione di sintesi del DNA
- Mescolare e girare brevemente ogni componente del kit prima dell'uso.
- Pr....
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Discussione
PtGen2 è sviluppata di recente, cDNA microarray personalizzati che è stato progettato per essere utilizzato principalmente dalla comunità di ricerca loblolly pino. I risultati preliminari generato finora hanno mostrato l'array di essere un valido strumento nella valutazione degli eventi trascrizionale che si verificano in risposta a stress idrico, così come nel monitoraggio dei cambiamenti che si verificano durante lo sviluppo embrionale in pino marittimo, Pinus pinaster 5,6 Abbiamo inoltre recen.......
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Ringraziamenti
L'etichettatura, ibridazione, e protocolli di lavaggio nel presente documento contiene alcune modifiche a quelli sviluppati in precedenza dal Dr. J. Quackenbush mentre presso l'Institute for Genomic Research (TIGR), il dottor Shawn Levy al Microarray Vanderbilt Shared Resource (VMSR), e il Dr. Rob Alba mentre al Boyce Thompson Institute, (ITV) Cornell University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Buffer di pre-ibridazione | Tampone | 5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA | ||
| Buffer di ibridazione | Tampone | 30% formammide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, RNA PolyA al 1% (Invitrogen, POLYA.GF), SDS allo 0,1% | ||
| Soluzione Lavaggio n. 1 | Tampone | 1X SSC, 0,2% SDS, preriscaldare a 43°C | ||
| Soluzione di Lavaggio n. 2 | Tampone | 0,1X SSC, 0,2% SDS | ||
| Soluzione di Lavaggio n. 3 | Tampone | 0,1X SSC | ||
| Alcol isopropilico | Reagente | Sigma-Aldrich | 34959-2,5 L | |
| Tubi conici da 50 mL | Altro | Falcon BD | 352070 | |
| Tubi conici da 15 mL | Altro | Falcon BD | 352196 | Utilizzare questo o un tappo simile posizionato alla base di ogni tubo conico da 50 mL durante la centrifugazione |
| Vaso Coplin | Wheaton | 900520 | ||
| Piatto per colorazione &e supporto | Altro | Wheaton | 900200 | |
| Albumina da siero bovino (BSA) | Altro | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| RNA poliA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| Etichettatura indiretta del cDNA con SuperScriptTM | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNasi | Kit | Ambion | AM1907 | |
| Sistema | ||||
| Colorante Cy-5 | Reagente | GE Healthcare | PA25001 | |
| Colorante Cy-3 | Reagente | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Altro | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Attrezzature | GeneMachines | JHYB200003 |
Riferimenti
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dhar....
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