In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.
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Articolo metodologico
Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo video, dimostriamo il metodo nostro laboratorio ha sviluppato per analizzare i cambiamenti delle cellule forma e riarrangiamenti necessari per piegare e ripiegare il cervello pesce zebra di sviluppo (Gutzman et al, 2008). Tale analisi offre una nuova comprensione della biologia cellulare di base necessari per lo sviluppo della struttura 3D del cervello dei vertebrati, e aumenta notevolmente la nostra capacità di studiare la morfogenesi del tubo neurale. Il cervello ha la forma embrionale di zebrafish con inizio alle 18 ore dopo la fecondazione (HPF), come i ventricoli all'interno del neuroepitelio gonfiare. Da 24 HPF, i passi iniziali della morfogenesi del tubo neurale sono completi. Utilizzando il metodo descritto qui, gli embrioni allo stadio di una cellula sono iniettati con mRNA codifica membrana mirati proteina verde fluorescente (memGFP). Dopo l'iniezione e l'incubazione, l'embrione, ormai tra i 18 ei 24 HPF, è montato, capovolta, in agarosio e fotografato al microscopio confocale. In particolare, l'embrione di zebrafish è trasparente che lo rende un sistema ideale per l'imaging a fluorescenza. Mentre le nostre analisi si sono concentrate sul mesencefalo e il romboencefalo confine romboencefalo, questo metodo potrebbe essere esteso per l'analisi di qualsiasi altra regione del zebrafish ad una profondità di 80-100 micron.
Protocollo
1. Preparazione del mRNA per iniezione
- L'mRNA utilizzati in questa procedura è trascritto da un plasmide codifica CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. In primo luogo linearizzare il plasmide secondo Gutzman et al, 2008.
- Poi trascrivere mRNA memGFP utilizzando il mMessage mMachine kit.
- Diluire l'mRNA risultante 1μg/μl, aliquota, e conservare a -80 ° C.
- Preparare uno stampo ad iniezione di 1% agarosio con corsie della larghezza di embrioni allo stadio di una cellula.
- Il giorno prima dell'iniezione, istituito gabbie accoppiamento che separa il maschio dalla femmina.
- Il giorno di iniezione, tirare aghi capillare con un est....
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Discussione
In questo video, si dimostra un metodo per iniezione di mRNA in embrioni di zebrafish singola cellula. Qui, usiamo mRNA codifica una membrana mirati GFP di etichettare ogni cella. Abbiamo poi dimostrare come montare e immagine lo sviluppo del cervello a risoluzione singola cellula. Questa tecnica ci ha permesso di studiare un nuovo tipo di cella di cambiare forma, costrizione basale, necessari per la formazione del mesencefalo-romboencefalo confine (Gutzman et al, 2008). Un'analisi simile di altri fenomeni ha il pot.......
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Ringraziamenti
Molte grazie a Dr. Jennifer Gutzman che per primo ha sviluppato questa tecnica in laboratorio Sive. Grazie anche a JB Verde presso il Dana-Farber Cancer Institute di Boston, MA che ha gentilmente fornito la codifica plasmide CAAX GFP-mRNA. L'imaging confocale è stato condotto presso il WM Keck Foundation Imaging Fondo Biologiche presso l'Whitehead. HS è supportato da NIHMH70926. EG è supportato da un pre-dottorato NSF.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Agarosio SeaKem GTG | Reagente | Lonza Inc. | 50027 | |
| Etil estere dell'acido 3-aminobenzoico (Tricaina) | Reagente | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Tubuli capillari | Strumento | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1,0 mmOD x 0,5 mmID/fibra 100 mm |
| Grasso per vuoto al silicone | Reagente | VWR international | W0S717 | |
| Pinzette | Strumento | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont n. 5 Bio Inox |
| Punte per pipetta 1-200 μl | Strumento | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | Sono della dimensione corretta per embrioni a 24 hpf. |
| Kit di trascrizione mMessage mMachine | Reagente | Ambion | AM1340 | Polimerasi RNA SP6 |
| Confocale a scansione Zeiss LSM 510 | Microscopio | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micromanipolatore | Strumento | Narishige International | ||
| Microiniettore | Strumento | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Tiratore di micropipette | Strumento | Sutter Instrument Co. |
Riferimenti
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laborat....
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