Descriviamo un metodo per l'estrazione di alto peso molecolare del DNA genomico da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 micron Sterivex, seguita da centrifugazione in gradiente di cesio cloruro di densità per la purificazione.
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Articolo metodologico
Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Questo metodo è utilizzato per estrarre DNA genomico ad alto peso molecolare peso da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 mM Sterivex che sono stati trattati con memorizzazione / buffer di lisi e archiviati a -80 ° C, e per purificare il DNA utilizzando un gradiente di densità di cloruro di cesio. Il protocollo inizia con due di un'ora le fasi di incubazione per liberare il DNA dalle cellule e rimuovere l'RNA. Poi, una serie di fenolo: cloroformio e estrazioni Cloroformio vengono eseguite seguita da centrifugazione per rimuovere le proteine e componenti della membrana cellulare, la raccolta del DNA estratto acquoso, e diverse fasi di scambio tampone per lavare e concentrare l'estratto. Parte quinta descrive la purificazione opzionale tramite gradiente di densità di cloruro di cesio. Si consiglia di lavorare con meno di 15 campioni in una sola volta per evitare confusione e ridurre i tempi del protocollo. Il tempo totale richiesto per questo protocollo dipende dal numero di campioni da estrarre. Per 10-15 i campioni e assumendo l'attrezzatura corretta centrifugazione è disponibile, questo protocollo intera dovrebbe prendere 3 giorni. Assicurarsi di avere i forni ibridazione impostata la temperatura all'inizio del processo.
Protocollo
Nota: Tutti i reagenti usati in questo protocollo sono aliquotati dalle scorte di laboratorio in piccoli stock di lavoro-questo è molto importante per evitare la contaminazione crociata dei campioni di DNA e la contaminazione delle scorte di laboratorio. Inoltre, quando pipettaggio, assicurarsi di modificare puntali per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate.
Parte prima: la lisi cellulare e digestione
- Iniziare questo protocollo da scongelamento i filtri Sterivex che contengono biomassa planctonica precedentemente concentrato sul ghiaccio. Per semplicità, qui descritta la procedura per l&#....
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Discussione
A seconda di quanti campioni devono essere trattati, questo può essere un tempo ad alta intensità procedura a causa delle due fasi di incubazione di un'ora, e il ripetuti lavaggi e le fasi di centrifugazione. E 'meglio pianificare due giorni interi per questa procedura di lasciare un sacco di tempo. Se ci sono problemi a far il volume finale dell'estratto nel tubo Amicon di ridurre fino a 200-500μl al momento della concentrazione del DNA e il lavaggio, prova a fare ulteriori lavaggi e centrifugazioni TE (rip.......
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Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. JJW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC e DAW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC, Killam e la fondazione TULA Centro finanziato per la diversità microbica e Evolution. SL è stato sostenuto dal Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 1 cc (ago 26G5/8) | BD Biosciences | 309597 | |
| Siringa da 1 ml (ago 26G5/8) | BD Biosciences | 309597 | |
| Provette Eppendorf da 1,5 ml | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| Provette da 15 ml | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Siringa da 5 cc | BD Biosciences | 309603 | |
| Dispositivi filtranti centrifughi Amicon® Ultra-4 | EMD Millipore | UFC801096 | Limite nominale del peso molecolare 10.000 |
| Butanolo | Fisher Scientific | A383-1 | Saturare con acqua (butanolo:acqua = 1:1) |
| Rotore per centrifuga, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrifuga Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cloruro di cesio | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Cloroformio:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Bromuro di etidio (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Sale disodico di acido etilendiamminotetraacetico diidrato | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Forno per ibridazione | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Tampone di lisi | Saccarosio 0,75 M, EDTA 40 mM, Tris 50 mM (pH 8,3) | ||
| Lisozima | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl di TE |
| Unità filtrante centrifuga Microcon® Ultracel YM-30 | EMD Millipore | 42410 | Limite di taglio a 50 bp |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Fenolo:Cloroformio:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinasi K | Qiagen | 19133 | |
| RNasi A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Transilluminatore a luce blu Safe Imager™ | Invitrogen | S37102 | |
| Dodecilsolfato di sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | SDS al 20% |
| Filtri Sterivex | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Centrifuga da banco | Eppendorf | 5415D | |
| Tampone TE, pH 8,0 | |||
| Base Trizma® | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Rotore per ultracentrifuga, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Provetta per ultracentrifuga (7X20 mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Portaprovette per ultracentrifuga | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrifuga Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
Riferimenti
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
