Method Article

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

DOI:

10.3791/1387

⸱

September 23rd, 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

In This Article

Summary

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Costruzione di una biblioteca con fosmid ambientale DNA genomico isolato dal continuum profondità verticale di un fiordo stagionalmente ipossia è descritto. La biblioteca clone risultante è raccolto in 384 pozzetti e archiviati per il sequenziamento a valle e screening funzionale con l'applicazione di un sistema automatizzato di raccolta colonia.

Abstract

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La stragrande maggioranza dei microbi in natura attualmente rimangono inaccessibili ai metodi di coltivazione tradizionali. Negli ultimi dieci anni, la cultura indipendente genomica ambientale (

Protocol

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Costruzione della libreria Fosmid è stato suddiviso in quattro fasi principali e suddivisi in più parti (vedi Fig.1 per una panoramica).

Fase I (vedi protocollo di "estrazione del DNA da 0,22 mM filtri Sterivex" [3])

Parte 1: catalizzate da enzimi lisi cellulare

Parte 2: La purificazione del DNA ambientale per centrifugazione CsCl gradiente di densità e di recupero del DNA

Parte 3: Controllo di qualità del DNA estratto mediante elettroforesi su gel

Fase II

Parte 1: passi la modificazione enzimat....

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Discussion

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Una procedura viene descritto come generare più efficiente un grande inserto biblioteca fosmid con il DNA genomico derivato da un campione d'acqua costiere. A monte di estrazione del DNA genomico è descritta in un protocollo separato [3].

Mentre il fosmid-libreria di produzione è un processo multistep, piano di almeno due o tre settimane, in tempo per l'intera procedura compresi tutti i passaggi quattro presentati. L'estrazione del DNA genomico è il passo più importante e tutte l.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Non ho nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. MT e SL erano supportati da borse di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution (CMDE). MT inoltre ricevuto il sostegno borsa di studio della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Passaggio II
CopyControl™ Kit di produzione per librerieFosmid Epicentre BiotechnologiesCCFOS110sufficiente per generare 9-10 librerie fosmid
SeaPlaque AgaroseCambrex50100
riscaldante di agitazioneCorningPC-420D
1.0X TAE tampone
CHEF Mapper XA sistema di elettroforesi a campo pulsato con modulo di raffreddamento e pompaa velocità variabileBio-Rad
λ DNA-HindIII DigestNew England BiolabsN3012S
MidRange I Marcatore PFGNew England BiolabsN3551S
10.000X SYBR GoldInvitrogenS11494
involucro di plastica per microondeSaran premium wrap
Safe Imager transilluminatoreInvitrogenS37102
GELase Agarose Gel-Digesting PreparazioneEpicentre BiotechnologiesG09100
bisturiFisher Scientific08-927-5D
Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-4 con membrana Ultracel-10EMD MilliporeUFC801024
Unità filtrante centrifuga Microcon YM-30 EMD Millipore42410
acqua priva di nucleasiAmbionAM9932
Kit di analisi Quant-iT PicoGreen dsDNA *2000 saggi*#InvitrogenP7589
riscaldatore digitale a blocchi secchiVWR international12621-088
d'acquaVWR international14231-854
centrifugaBeckman Coulter Inc.Avanti J-E
Beckman Coulter Inc.Centrifuga da tavolo JA 5.3
Eppendorf5415D
, 1,7 mL, trasparentiAxygen ScientificMCT-175-C
Provette da centrifuga da 15 mL Fisher Scientific430052
Step III
LB brodoFisher ScientificBP 1426-2
MgSO4Sigma-AldrichM2643
diluizione fagica10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
criogenicofiale Fisher Scientific430488
Step IV
96 pozzetti con coperchioFisherScientific CS003370( 3370)
Piastra a 384 pozzetti con coperchioFisher Scientific07201157(3680)
Piastre di Petri 100 O.D. x 15mm HFisher Scientific08-757-12
Piastre di Petri 150 Ø x 15mmHFisher Scientific08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mmVWR international
gliceroloSigma-AldrichG5516
cloramfenicoloSigma-AldrichC0378
LB brodoFisher ScientificBP 1426-2
Difco AgarBD Biosciences214530
perle di vetroFisher Scientific10-310-1
QFill3GenetixX3050
candegginaJavex
EtanoloSigma-AldrichE7023
Provette da centrifuga da 15 mLFisher Scientific430052
Raccoglitore di colonie QPixGenetixQPix2
Testa di raccolta (E. coli) GenetixX4006
piastra di corsa bagno Rotore per centrifuga Provette per microcentrifuga tampone di CABD351040

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.

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