Per rendere lentivirus, vettori di DNA sono transfettate in 293 cellule umane. Dopo la raccolta e concentrando il surnatante, titolo del virus è determinata dalla espressione fluorescenza con un citometro a flusso.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Interferenza dell'RNA (RNAi) è un sistema di silenziamento genico nelle cellule viventi. In RNAi, i geni omologhi in sequenza a breve RNA interferenti (siRNA) sono ridotti al silenzio a livello post-trascrizionale di stato. RNA tornante breve, precursori di siRNA, può essere espressa tramite lentivirus, consentendo RNAi in una varietà di tipi di cellule. Lentivirus, come il virus di immunodeficienza umana, sono in grado di infettare sia che divide e non divisione delle cellule. Ci descrivono una procedura che a lentivirus pacchetto. Imballaggio si riferisce alla preparazione di virus competente da vettori del DNA. Lentivirali sistemi di produzione vettoriali sono basati su un sistema 'split', in cui il genoma virale naturale è stata suddivisa in costrutti individuali plasmide helper. Questa divisione dei diversi elementi virale in quattro vettori separati diminuisce il rischio di creare una replica-virus in grado di ricombinazione casuale del genoma lentivirali. Qui, un vettore contenente i shRNA di interesse e di tre vettori imballaggio (p-VSVG, pRSV, pMDL) sono transitoriamente trasfettate in 293 cellule umane. Dopo almeno un periodo di 48 ore di incubazione, il surnatante contenente virus viene raccolto e concentrato. Infine, titolo del virus è determinata dalla giornalista (fluorescenti), espressione con un citometro a flusso.
Protocollo
Parte 1: Transfection di HEK 293 cellule di produrre lentivirus
* 24 ore prima della trasfezione, piatto 2,5 X 10 6 celle in un piatto di 10 centimetri per una confluenza del 50-70% il giorno successivo.
- Avviare questo protocollo preparando il DNA con la quale si verrà poi trasfezione proprio le cellule per fare virus. In primo luogo, diluire FuGENE 6 Transfection Reagent Roche, un reagente lipidi che compongono le cellule prendono il DNA. In un tubo da 1,5 ml, pipetta 30μl FuGENE 6 in 600ul mezzo privo di siero (SFDMEM). Fare attenzione a non lasciare FuGENE toccare il lato del tubo in condizioni di fornitura nel me....
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Ringraziamenti
Sandler Asma base Research Center (SABRE)
Sandler Foundation
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM cell HEK 293T penicillina-streptomicina glutammina soluzione salina tampone al fosfato FBS | Invitrogen | ||
| Reagente per trasfezione FuGENE 6 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche Group | ||
| Candeggina | Clorox | ||
| Piastre per colture cellulari da 10 cm piastre per colture cellulari da 96 pozzetti | Falcon BD | 353003 | |
| Pipetta multicanale | Rainin | ||
| Punte filtrate per pipetta | Rainin | ||
| Tube Eppendorf da 1,5 ml siringa filtro per siringa (0,45-μm) | Eppendorf | ||
| Tube per ultracentrifuga | Beckman Coulter Inc. | ||
| Incubatore per colture cellulari al 5% di CO2 | Coulter | ||
| Rotore Beckman SW41T.I | |||
| Ultracentrifuga Beckman | Beckman Coulter Inc. | ||
| Microscopio a fluorescenza | Coulter | ||
| FACS Array | Beckman Coulter Inc. |
Riferimenti
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
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Ristampe e permessi
