Cellule progenitrici endoteliali formanti colonia (ECFCs) sono uno strumento promettente per studiare l'omeostasi vascolare e la riparazione. 1,2 Questo documento introduce un nuovo metodo di siero animale libero per l'isolamento e l'espansione del ECFC da eparinizzato adulti sangue umano periferico con un pool di lisato piastrinico umano (pHPL) diminuendo il rischio di immunizzazione anti-bovino.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo lavoro introduce una nuova strategia di recupero per le cellule progenitrici endoteliali formanti colonia (ECFCs) da eparinato ma per il resto non manipolata adulto periferici umani all'interno di una media di 12 giorni. Dopo l'espansione su larga scala> 1x10 8 ECFCs può essere ottenuto per ulteriori test. Vantaggiosamente utilizzando pHPL il contatto delle cellule umane con antigeni siero bovino può essere escluso. Mediante citometria di flusso ed immunoistochimica delle cellule isolate può essere caratterizzato come ECFC e la loro funzionalità in vitro per formare strutture di tipo vascolare possono essere testati in un test di Matrigel. Inoltre queste cellule possono essere iniettati per via sottocutanea in un modello murino di forma funzionale, vasi perfusi in vivo. Dopo un lungo periodo di espansione e la proliferazione crioconservazione, la funzione e la stabilità genomica sembrano essere conservati. 3,4
Questo animale-proteina isolamento libero e il metodo di espansione è facilmente applicabile a generare una grande quantità di ECFCs.
Protocollo
A.) ECFC ISOLATON
GIORNO 1:
- Prima di iniziare con l'esperimento preparare la cultura della crescita delle cellule endoteliali medio a medio-2 (EGM-2). Supplemento 500ml endoteliale basale medio-2 con eparina (1 ml di 1000 U / ml), 5 ml soluzione 100x di penicillina / streptomicina (tutti Sigma, St. Louis, MO, www.sigmaaldrich.com ), L-glutamina (concentrazione 2 mM finale ), e 50 ml pool lisato piastrinico umano (pHPL). Quindi aggiungere 0,2 ml di idrocortisone, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml di VEGF, EGF 0,5 ml, 0,5 ml di IGF-1 e 0,5 ml di acido ascorbico (fornito come SingleQuots, tutti Lonza,....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo isolamento romanzo e il metodo di espansione è un processo semplice ed efficiente che è più efficiente e meno che richiede tempo, evitando qualsiasi separazione cellulare (gradiente di densità non necessario) e meno costoso rispetto alle tecniche convenzionali. Usando contatto pHPL agli antigeni della specie bovina e putativo xenoimmunization successivo è esclusa. Durante il periodo di cultura piccoli coaguli si possono formare, causata dal pHPL. Sulla base della nostra esperienza di questi coaguli di non effetto.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dott. Katharina Schallmoser per la fornitura di pHPL e Margaretha Frühwirth e Daniela Thaler per un'eccellente assistenza tecnica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mezzo basale per endoteliali-2 | Lonza Inc. | 500 ml | |
| SingleQuots EGM-2 | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, idrocortisone, acido ascorbico | |
| Eparina senza conservanti | Biochrom AG | 10 U/ml per EGM-2 | |
| L-Glutammina | Sigma-Aldrich | 2 mM per EGM-2 | |
| Penicillina e Streptomicina | Sigma-Aldrich | 100 U/mL di penicillina e 100μg/mL di streptomicina per EGM-2 | |
| Tripsina/EDTA 1 mM | Invitrogen | 7 ml per fiala T75 70 ml per CF-4 | |
| PBS | |||
| Cell factory a quattro strati (CF-4) | Corning | ||
| Imbuto sterile | Corning | ||
| Fiala da coltura T75cm2 (con tappo ventilato) | Corning | ||
| Tubi vacutainer da 6 mL (eparina sodica senza conservanti) | BD Biosciences | precaricati con 108 UI/6 ml di eparina sodica senza conservanti | |
| Tubi Falcon da 50 ml | Falcon BD | ||
| Stripette da 5 ml | Costar | ||
| Stripette da 25 ml | Costar | ||
| Squeezer | Costar | ||
| Filtro sterile con pori da 0,2 | EMD Millipore | 2x 500 ml per EGM-2 |
Riferimenti
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells vi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
