Purificazione della popolazione di cellule specifiche per fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS)

Summary

Per molti studi scientifici che richiedono una analisi biologiche e chimiche delle popolazioni di cellule le cellule devono essere in uno stato di purezza. Fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) è un metodo superiore, in cui per ottenere popolazioni di cellule pure.

Abstract

Studi sperimentali e clinici spesso richiedono popolazioni di cellule altamente purificato. FACS è una tecnica di scelta per purificare le popolazioni di cellule fenotipo noto. Altri metodi di purificazione di massa comprendono panning, esaurimento integrare e separazione magnetica tallone. Tuttavia, FACS ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi disponibili. FACS è il metodo preferito quando purezza molto elevata della popolazione desiderato è necessario, quando la popolazione di cellule bersaglio esprime un livello molto basso del marcatore di identificazione o quando popolazioni di cellule richiedono la separazione in base alla densità differenziale marcatore. Inoltre, FACS è l'unica tecnica di purificazione a disposizione di isolare le cellule in base alla colorazione interna o espressione della proteina intracellulare, come un marcatore geneticamente modificati proteina fluorescente. FACS permette la purificazione di singole cellule in base alle dimensioni, granularità e fluorescenza. Al fine di purificare le cellule di interesse, vengono prima colorati con fluorescenza-tagged anticorpi monoclonali (mAb), che riconoscono specifici marcatori di superficie sulla popolazione cella desiderata (1). Selezione negativa di cellule senza macchia è anche possibile. FACS purificazione richiede un citofluorimetro con capacità di smistamento e il software appropriato. Per FACS, le cellule in sospensione sono passati come un flusso in gocce con ciascuno dei quali contiene una singola cella di fronte a un laser. Il sistema di rilevamento a fluorescenza rileva le cellule di interesse sulla base di predeterminati parametri di fluorescenza delle cellule. Lo strumento si applica un addebito per la goccia che contiene una cella di interesse e di un sistema di deflessione elettrostatica agevola la raccolta delle gocce addebitato in provette di raccolta (2). Il successo della colorazione e, quindi, l'ordinamento dipende in gran parte alla selezione dei marcatori individuazione e la scelta di mAb. Parametri di ordinamento può essere regolata a seconda del requisito della purezza e della resa. Anche se FACS richiede attrezzature specializzate e formazione del personale, è il metodo di scelta per l'isolamento delle popolazioni di cellule altamente purificato.

Protocol

1. Prima di avviare il processo, i seguenti elementi devono essere raccolte e preparate per:
   1. Ghiaccio
   2. Provette da 15 ml per le cellule colorazione e 12 x 75 mm per tubi di flusso colorazione controlli singolo colore.
   3. Colorazione buffer: tampone fosfato salino (PBS) + 3% di siero fetale bovino (FCS)
   4. Pipette
   5. Fc bloccare (se necessario) e gli anticorpi colorazione. Gli anticorpi devono essere titolati per la colorazione ottimale.
   6. Compensazione perline
   7. Buffer di sospensione: soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) + 25 HEPES mM + 3% FCS
   8. Trypan blu e emocitometro
   9. Cellule filtro (40 micron nylon)
   10. Provette per la raccolta: due tipi di tubi di raccolta può essere utilizzato a) 12 x 75 tubi in polistirolo mm (contenente 300 ml di FCS e 25 HEPES mM) o b) 15 ml provette coniche (FCS contenente 1 ml + 25 HEPES mM). Qualsiasi mezzo ricco di alta concentrazione sierica può essere utilizzato per la raccolta di cellule ordinati.
2. Generare una sospensione singola cella della popolazione di cellule di partenza.
3. Opzionale: Arricchire per la popolazione cella desiderata con un metodo di purificazione di massa quali la riduzione del complemento o di smistamento magnetico. Il vantaggio principale della fase di arricchimento è che riduce il tempo di sorta.
4. Lavare le cellule una volta con colorazione buffer.
5. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in colorazione tampone ad una concentrazione fino a 50 x 10 ⁶ per la colorazione efficiente.
6. Opzionale: Per le cellule che esprimono alti livelli di FCR, bloccare i recettori utilizzando un metodo appropriato di blocco. Un metodo di scelta è l'utilizzo di un anticorpo monoclonale che si lega a FcγR in ghiaccio per 10-15 minuti. Questi anticorpi sono disponibili in commercio.
7. Aggiungere la appropriato mAb (a una concentrazione predeterminata) per colorare la popolazione cella desiderata e incubare per 20-30 minuti sul ghiaccio al buio, seguito da due lavaggi con tampone colorazione. Opzionale: colorazione con un colorante vitale, come lo ioduro di propidio, possono essere usate per discernere le cellule morte (5). Se multicolore colorazione deve essere utilizzato, i controlli solo colore sono obbligatori. Noi usiamo CompBeads BD per preparare i controlli singolo colore utilizzando il protocollo del produttore.
8. Se non si utilizza direttamente gli anticorpi coniugati, ripetere il punto 7 con l'anticorpo secondario appropriato o coniugato streptavidina.
9. Dopo il lavaggio, risospendere le cellule in terreno di coltura e determinare la concentrazione di cellule utilizzando un colorante vitale come tripan blu.
10. Regolare la concentrazione cellulare a 15-20 x 10 ⁶ / ml. Per le popolazioni di cellule che formano i cluster, che possono ostruire lo strumento durante l'ordinamento, filtrare le cellule attraverso un colino.
11. Impostare e ottimizzare la cell sorter. Il processo di creazione di un citofluorimetro varia a seconda della produzione e deve essere eseguita da personale adeguatamente addestrato.
    Le raccomandazioni generali sono i seguenti:
    1. Selezionare l'ugello appropriato a seconda del tipo di cellula da ordinare.
    2. Per i tipi sterile, sterilizzare lo strumento.
    3. Effettuare il controllo della qualità dello strumento con perline di verificare i laser funzionano, ed è l'ordinamento con precisione.
    4. Installare il dispositivo richiesto raccolta e impostare i torrenti laterali.
    5. Guarda laser dello strumento e il rivelatore fissati per determinare le etichette fluorescenti che possono essere utilizzati (il nostro BD FACS Aria ha tre laser e in grado di rilevare fino a nove colori).
    6. Una volta determinato ciò etichette fluorescenti saranno utilizzati sul cell sorter, la compensazione può essere effettuata (come spiegato di seguito).
12. Eseguire compensazione con il campione di controllo negativo e positivo i controlli singoli. La compensazione è necessario rimuovere la sovrapposizione dello spettro tra due rivelatori. E 'il caso di osservare che la compensazione non è infallibile ed è influenzata negativamente da come brillantemente alcuni marcatori macchia, e con la fluorescenza delle cellule che hanno autofluorescenza basso, che può portare ad una risoluzione molto bassa tra le popolazioni debole e negativo.
    Per ottenere i migliori risultati, il disegno sperimentale dovrebbe includere utilizzando fluorocromi luminoso con marcatori che hanno una bassa espressione o che non hanno un pattern di colorazione nota. Marcatori che garantiscono una buona separazione tra le popolazioni delle cellule e sono altamente espresso deve essere usato con fluorocromi dimero come quelli eccitati dal laser di colore rosso o viola.
    1. Compensazione può essere eseguita con perline di compensazione, che sono microparticelle di polistirene che è stato accoppiato ad un anticorpo specifico per la catena leggera Kappa di Ig di topo, ratto o topo / criceto. Le perle sono facili da macchia, un segnale forte e forniscono un modo semplice di preparare singoli controlli che hanno macchiato il fluoroforo stesso i campioni sperimentali.
    2. Impostare un modello che include un complotto bivariata per visualizzare scatter in avanti (FSC) e side scatter (SSC), e uno istogramma perogni fluorocromo che verrà utilizzato.
    3. Esegui il tubo di controllo negativo e regolare la dispersione in avanti (FSC) e side scatter (SSC) per posizionare la popolazione di interesse su scala.
    4. Regolare le impostazioni PMT fluorescenza per posizionare la popolazione negativo o autofluorescenza nella porzione mano all'estrema sinistra dell'istogramma.
    5. Registra il tubo di controllo negativo.
    6. Eseguire i tubi singolo controllo positivo e registrare i dati per ogni tubo.
    7. Disegnare un cancello intervallo intorno alla parte positiva dei dati sul istogramma, e un altro cancello intervallo sulla porzione negativa dell'istogramma.
    8. Compensazione manuale viene effettuata regolando la mediana (mediana è una stima migliore della tendenza centrale rispetto alla media su una scala logaritmica) dei positivi fino a quando non è uguale alla media dei negativi. Questo deve essere fatto per ciascuna delle etichette fluorocromo utilizzato nell'esperimento.
    9. Per regolare la mediana, regolare i valori spettrali si sovrappongono sia superiore o inferiore fino a quando le mediane per ogni partita parametro fluorescente il più possibile.
    10. Compensazione può essere effettuata anche automaticamente con il software di analisi. Compensazione automatica utilizza i dati registrati dai controlli di compensazione per calcolare una matrice algebrica di tutti i fluorofori utilizzati nell'esperimento. Questi valori vengono utilizzati per sottrarre i contributi dei non-colori primari che sono il sanguinamento in rivelatore di un colore primario.
13. Registrare il campione sperimentale da ordinare e utilizzare strumenti e metodi di sottoinsiemi gating per definire le popolazioni di interesse.
    1. Impostare il modello sperimentale con un dot plot che mostra FSC vs SSC e utilizzare uno strumento di gating, poligono, rettangolo, intervallo o al quadrante porta la popolazione di interesse. Il grafico a dispersione visualizza le proprietà fisiche della cellula che è distinto per il tipo di cellula.
    2. Il modo migliore per determinare la strategia di fluorescenza gating è quella di utilizzare fluorescenza meno uno (FMO) controlli. In una provetta di controllo FMO tutti i reagenti utilizzati nell'esperimento sono inclusi ad eccezione di quello di interesse. La FMO aiuta a discriminare tra le popolazioni scarsamente colorati e ampia popolazioni negativo.
    3. Utilizzare i dati registrati da tubi FMO a determinare la posizione cancelli all'interno del tubo sperimentale.
14. Una volta che cancelli sono stati determinati, le porte possono essere selezionati per l'ordinamento in tubi di raccolta esterni. Fino a quattro porte (o popolazioni) possono essere ordinati in una sola volta a seconda della strumentazione disponibile.
15. Esegui il tubo sperimentale campione a 4 ° C, girare su piatti di deflessione, e ordinare il campione. 5 x 10 ⁵ -1,5 x 10 ⁶ cellule possono essere ordinati in un tubo di 12 x 75 mm e 1,5 x 10 ⁶ - 4,5 x 10 ⁶ cellule possono essere ordinati in un ml 15.
16. Una volta che il numero di cellule è stata ottenuta, interrompere manualmente l'ordinamento.
17. Eseguire una sorta di post-analisi per determinare la purezza delle popolazioni cellulari ordinati.

Rappresentante risultati

Abbiamo mostrato qui i risultati per B del mouse splenica e l'ordinamento delle cellule T CD4 (Figura 1). Splenociti sono state colorate con PE Texas Red-coniugato anti-topo B220, FITC-coniugato anti-topo TCRβ e Alexafluor-700-coniugato anti-topo CD4 per identificare le cellule B (B220 + TCRβ-) e le cellule T CD4 (CD4 + + TCRβ ). La selezione è stata effettuata con lo strumento BD FACS Aria. Dopo la cernita la purezza delle cellule B era> 97% e la purezza delle cellule T CD4 era> 98%.

Figura 1. La purezza delle cellule B della milza e le cellule T CD4 dopo FACS. Splenociti topo sono state colorate con anticorpi anti-topo B220, TCRβ e anticorpi CD4. FACS per le cellule B è stata effettuata utilizzando un BD FACS Aria di gating su B220 + TCRβ-cellule (Fig. 1A, pannello di sinistra, quadrante in basso a destra). Una sorta di analisi post è stato eseguito per determinare la purezza delle cellule B (Fig. 1A, pannello di destra). Colorazione B220 viene visualizzato l'asse delle ascisse e colorazione TCRβ sulla y.. FACS di cellule T CD4 è stata eseguita con lo stesso citometro di flusso di gating su TCRβ + cellule CD4 + (Fig. 1B, pannello di sinistra, quadrante superiore destro). Una sorta di analisi post è stato eseguito per determinare la purezza delle cellule T CD4 (Fig. 1B, pannello di destra). Colorazione TCRβ viene visualizzato l'asse delle ascisse e CD4 macchie sulla y.. Le cellule positive per cento in ogni quadrante viene visualizzato.

Discussion

FACS è una tecnica altamente sofisticata per purificare popolazioni cellulari di interesse, in cui una purezza molto elevata (95-100%) della popolazione ordinati può essere ottenuto. Pertanto, questa tecnica è particolarmente importante per gli esperimenti, in cui elevata purezza è un requisito essenziale (ad esempio l'analisi microarray). FACS è particolarmente vantaggioso rispetto ad altri metodi disponibili di purificazione in cui una popolazione di cellule ha bisogno di essere purificata sulla base di un indicatore settimanale superficie espressa o quando due o più popolazioni bisogno di essere purificati, che hanno diversi livelli di espressione del marcatore di superficie stesso. Per esempio, la purificazione delle cellule B della zona marginale (B220 CD23 ⁺ CD21 ^{hi int / basso)} e le cellule B follicolari (B220 ⁺ CD21 ^{int / hi basso} CD23) sulla base di livelli di espressione di CD21 e CD23. Un'altra applicazione crescente di FACS è smistamento singola cella che permette l'analisi delle singole cellule (3, 4). FACS è anche comunemente usato per le cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti tipo che sono espressione genetica, come la proteina fluorescente verde proteine ​​tag (5). Se una sorta sterile viene eseguito le cellule possono essere coltivate. Tuttavia, la vitalità delle cellule e il rendimento può essere compromessa durante l'ordinamento. Vitalità può essere migliorata utilizzando una cella dipendente dalla temperatura ottimale per la cernita e lavorazione tubi da collezione subito dopo il raggiungimento di capacità. Recupero può essere aumentata utilizzando provette in polipropilene, raccogliendo le cellule ordinati nel siero rich media e provette per la raccolta invertendo ad intermittenza, il mantenimento di tubi di raccolta ad una temperatura ottimale e la centrifugazione le cellule ordinati per circa 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm).

Lo sviluppo di ultra ad alta velocità selezionatori ha esteso la possibilità di applicazione di smistamento del flusso in ambito clinico. Le potenziali applicazioni cliniche di FACS comprendono purificazione delle cellule staminali da sangue umano a scopo terapeutico, le applicazioni nella terapia del cancro, la sostituzione amniocentesi, l'ordinamento dello sperma umano e rilevamenti malattia in fase precoce (6, 7).

Per la colorazione multicolore, la selezione degli anticorpi è un passo critico e fluorocromi sono scelti in base al sistema di rilevazione per ogni strumento. Ci sono un certo numero di aziende che vendono i selezionatori delle cellule e la configurazione del laser varia a seconda delle esigenze degli utenti. Così non si può semplicemente utilizzare gli anticorpi esattamente lo stesso utilizzato in studi pubblicati senza confermare la compatibilità. Per la selezione degli anticorpi ottimali, si dovrebbe considerare il livello di espressione della proteina in esame. In generale, più brillanti gli anticorpi disponibili fluorocromo-tag deve essere usato per colorare marcatori di superficie debolmente espressa, mentre dim fluorocromi possono essere usati per la colorazione dei marcatori di superficie altamente espresso (8). Inoltre, gli anticorpi dovrebbero essere selezionati in modo tale che si sovrappongono tra loro spettri di emissione è minima. Per la colorazione multicolore, è estremamente difficile scegliere fluorocromo che non hanno sovrapposizione spettrale. In questa situazione, la compensazione viene eseguita.

La compensazione è necessario eliminare matematicamente la sovrapposizione tra lo spettro di fluorescenza emissioni dei vari fluorocromi che è misurabile dai rivelatori (8-10). In altre parole, la sovrapposizione fluorescenza da un fluorocromo viene sottratto dallo spettro delle emissioni di un altro fluorocromo. Il calcolo dell'indennità implica un controllo senza macchia e singoli controlli positivi per ogni fluorocromo utilizzato per una colorazione multicolore (9, 10). La compensazione può essere condotta utilizzando cellule o perline. Le perle sono facili da macchia, un segnale forte e forniscono un modo semplice di preparare singoli controlli che hanno macchiato la fluorofori stessi dei campioni sperimentali. Perle di compensazione sono particolarmente vantaggiosa quando la proteina della superficie delle cellule di interesse è espresso ad un livello basso e quando la popolazione di cellule è limitante nella popolazione iniziale di cellule di partenza.

Una volta che gli anticorpi sono stati scelti, la loro attività deve essere ottimizzata per l'esecuzione di un'analisi di titolazione. Ciò è particolarmente importante se la macchina è FACS laser molto potenti. L'uso di concentrazioni non ottimali di anticorpi colorazione può portare alla separazione povera della popolazione cellulare desiderato dalla popolazione cellulare totale. L'uso di alte concentrazioni di anticorpi aumenta la possibilità per l'antigene di colorazione aspecifica. Quindi la titolazione degli anticorpi permetterà la selezione della concentrazione anticorpale che dà la massima luminosità della popolazione positivo e la colorazione di fondo minima (8).

FACS è ormai una tecnica standard per la purificazione delle sottopopolazioni di cellule. Può essere utilizzato per separare qualsiasi tipo di cellula in cui una sospensione singola cellula può essere generata e gli anticorpi sono a disposizione per identificare la popolazione cellulare desiderato. FACS è il metodo di scelta quando highly popolazioni di cellule pure sono necessari.