Metodi per lo studio del mascellare Zebrafish Barbel

Sommario

Il pesce zebra mascellare barbi è un organo di senso tegumentario contenente ectodermica, mesodermica e derivati ​​della cresta neurale. È importante sottolineare che il barbo adulti in grado di rigenerare dopo l'amputazione prossimale. Questo video presenta mascellare sviluppo barbi e dimostra un protocollo chirurgico per indurre la rigenerazione, seguita dalla raccolta di immagini, l'incorporamento ea valle dei campioni barbo.

Abstract

Barbi sono annessi cutanei sensoriali si trovano in pesci, rettili e anfibi. Il pesce zebra, Danio rerio, sviluppa due paia di barbigli: un paio nasale corta e un paio più mascellare. Barbel tessuto contiene cellule di origine ectodermica, e l'origine mesodermica cresta neurale, incluse le cellule della pelle, ghiandole, papille gustative, melanociti, vasi circolatori e nervi sensoriali. Diversamente dalla maggior parte dei tessuti adulti, il mascellare barbi è otticamente chiaro, che ci permette di visualizzare lo sviluppo e la manutenzione di questi tipi di tessuto per tutto il ciclo di vita.

Questo video mostra lo sviluppo iniziale del mascellare barbi (inizio circa un mese dopo la fecondazione) e dimostra un protocollo chirurgico per indurre la rigenerazione in appendice adulti (> 3 mesi dopo la fecondazione). In breve, il barbo mascellare sinistro di un pesce anestetizzato è elevata con una pinza sterile, appena distalmente al bordo caudale della mascella. Un bene, forbici sterili primavera è posizionato contro la pinza per tagliare l'albero barbi a questo livello, che istituisce un punto di riferimento anatomico per il piano di amputazione. Crescita rigenerativa può essere misurata rispetto a questo piano, e rispetto al controlaterale barbo. Tessuto Barbel rigenera rapidamente, raggiungendo la ricrescita massimo entro 2 settimane dalla lesione.

Tecniche di analisi del rigenerato barbi includono la dissezione e l'incorporamento di coppie di barbigli (rigenerare e controllo) nei pozzetti di un gel elettroforesi standard di DNA. I campioni sono opportunamente integrati fotografato allo stereomicroscopio per la morfologia e la morfometria lordo, e può essere conservato per settimane prima di applicazioni a valle come istologia paraffina, criosezionamento, e / o immunoistochimica montare tutto. Questi metodi stabilire il barbi mascellare come un romanzo nel sistema del tessuto in vivo per lo studio della capacità rigenerativa di più tipi di cellule nel contesto genetico di zebrafish.

Protocollo

Zebrafish allevamento

Zebrafish sono alloggiati e allevati secondo i metodi standard ^1. Passato il periodo tardo larvale, lo stadio di sviluppo di un pesce zebra può essere misurata dalla sua lunghezza standard (SL), o la distanza retta in millimetri dal punto anteriormost del labbro superiore alla base della pinna caudale (posteriormost piastra hypural) ^2. A circa un mese dopo la fecondazione (10-12 mm SL), i barbigli nasali e mascellari appaiono gemme epiteliali come trasparente vicino al box olfattive e sugli angoli posteriori dei mascellari, rispettivamente. Come il pesce zebra matura, il barbi si estendono in strette, baffi appendici simili. Perché il mascellare barbi è più grande (2-3 mm) e più facile da manipolare, il nostro protocollo si applica solo a questa appendice particolare; tecniche simili, tuttavia, potrebbero essere adattati alle più piccole la nasale barbo.

Barbel Clipping

1. Anestetizzare zebrafish adulti nella fase desiderato (ad es., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 mesi dopo la fecondazione) mediante immersione in 0.015% MS-222 (3-etil amminobenzoato metanosolfonato) tamponata a pH 7,0 in acqua sistema. Osservare i movimenti fino nuotare fermarsi e ventilazione branchie diventa lento e regolare. A seconda della dimensione, l'anestesia completa dura circa 2-5 minuti.
2. L'utilizzo di un acquario a rete, il trasferimento di pesce 1-3 alla volta per un pezzo piegato su un tovagliolo di carta umido in una capsula di Petri. Con una spatola smussato, orientare il pesce in modo che siano paralleli tra lato e laterale sinistro alto. Parte piega il tovagliolo di carta bagnato sulla parte caudale del pesce, che copre tutto il corpo fino alla opercolo (opercoli branchiali) per mantenere la pelle e le branchie umide durante la procedura.
3. Vista la piastra Petri con lo stereomicroscopio, con basso angolo di luce incidente ad illuminare la regione della testa. Focus sulla base della sinistra barbi mascellare, che sporge da un angolo posteriore ventrale del mascellare (Fig. 1).
   
   Figura 1.
4. Afferrare saldamente l'asta del distale leggermente verso il bordo della mascella barbo. Elevare l'albero barbi e inserire le fauci di un punta fine forbici primavera appena prossimale al forcipe. Le forbici possono essere toccati per le pinze per la stabilità. Far scorrere le mascelle delle forbici lungo l'asta del barbi fino a quando la punta di diamante si avvicina al bordo della mascella. Chiudere la forbice per tagliare l'albero barbo. Il barbo amputato, ancora alle prese con pinza, può essere rimosso per la fissazione o ulteriori osservazioni.
5. Trasferire immediatamente il pesce a un piccolo serbatoio di acqua pulita del sistema (~ 500 ml) contenente una goccia di blu di metilene per il controllo superficiale infezioni fungine. Lasciare che il pesce di recuperare durante la notte. Il mattino seguente, ritorno il pesce al sistema di allevamento. Barbel rigenerazione è massima dopo 2 settimane.

Incorporare agar di Matched Pairs Barbel

1. Raccogliere i pesci con la tecnica appropriata e l'eutanasia fissare in un tubo 50 ml di paraformaldeide al 4%-tampone fosfato (PBS) con agitazione a 4 ° C durante la notte. Il volume del fissativo deve essere almeno dieci volte il volume del tessuto. Dopo la fissazione, lo smaltimento dei rifiuti paraformaldeide in un contenitore approvato e lavare accuratamente il tessuto in diversi cambiamenti di PBS.
2. Preparare in un bicchiere da 250 mL pallone da 150 mL di agarosio al 2% (T _m ~ 37 ° C) in acqua distillata. Calore con un forno a microonde o sulla piastra riscaldante, agitare periodicamente fino a completo scioglimento. Equilibrare la soluzione fuso in A ° C 50-60 bagnomaria.
3. Assemblare un impianto standard di elettroforesi su gel mettendo un piccolo stampo gel guarnizione (10 x 10 cm; ~ 100 volumi gel mL) saldamente contro i lati della camera di buffer. Aggiungere 2-4 piccoli pettini a denti campione (4 x 1,5 mm).
4. Su una superficie piana, versare l'agarosio fuso nello stampo per coprire solo la base del pettine, formando pozzi molto superficiale. Subito messo l'agarosio rimasto indietro nel bagno d'acqua calda, che sarà utilizzato in seguito per integrare il tessuto (Piazza di 9-12). Metti una lunga pipetta Pasteur di vetro nel pallone per mantenere la pipetta alla stessa temperatura del agarosio.
5. Lasciare indurire il gel per 20-30 minuti. Rimuovere i favi, quindi rimuovere lo stampo gel contenente il gel indurito dalla camera buffer. Saldamente nastro i lati aperti dello stampo gel con del nastro di laboratorio in modo che il gel non scivolare fuori. Questo nastro dovrebbe estendersi diversi millimetri sopra la superficie del agarosio in modo che ulteriori agarosio può essere aggiunto in seguito (Step 13).
6. Posizionare lo stampo gel sul palco di uno stereomicroscopio. Ingrandire un pozzo vuoto e portare i bordi a fuoco.
7. Sulla superficie adiacente al pozzo agarosio, pipetta una goccia d'acqua o tampone contenente i campioni fissati barbi (ad esempio, rigenerarsi e di controllo). USIng piegato perni insetti, trascinare i campioni umidi nel pozzo e spingerli verso il basso. Orientare il barbi alberi paralleli l'uno all'altro e allineati contro opposto lungo i bordi del pozzo. Tensione superficiale contribuirà a tenere il tessuto in posizione.
8. Quando si è pronti ad inserire, utilizzare una punta sottile pipetta o l'angolo di un laboratorio di tessuti per rimuovere il liquido in eccesso dal pozzo. Lavorare velocemente per non lasciare che il tessuto asciugare.
9. Utilizzando la pipetta Pasteur in vetro riscaldato, delicatamente fresco pipetta agarosio fuso dentro e intorno i campioni per sigillare il tessuto barbi in posizione. Non riempire troppo. Prima l'agarosio si indurisce, fare aggiustamenti dell'ultimo minuto con i perni di insetti.
10. Inserire una etichetta numerata campione di carta accanto al pozzo e fissarlo con una piccola goccia di agarosio.
11. Ripetere i passaggi da 6 a 10 per ciascun pozzetto di campioni.
12. Se lo si desidera per la calibrazione di immagini, inserire un pezzo di carta con una scala micrometrica stampata (ad esempio, http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) nel fondo di un pozzo vuoto. Appiattire la carta sul fondo del pozzo e coprire con caldo agarosio.
13. Dopo che tutti i campioni sono incorporati, la superficie del gel sarà irregolare, con gocce indurite di agarosio. Posizionare il gel su una superficie piana e delicatamente versare ulteriori agarosio fuso fino a quando la superficie superiore è uniforme. Utilizzare la più piccola quantità di agarosio necessaria per ottenere una superficie liscia, troppo agarosio oscurerà a luce trasmessa fotografia. Permettere che questo strato superiore ad indurirsi.
14. Il gel può essere fotografato sul palco di uno stereomicroscopio per registrare morfologia lordi per ogni coppia barbo. Calibrazione immagine è ottenuta fotografando la scala micrometrica incorporato.
15. Il gel intero possono essere conservati avvolti in tovaglioli di carta bagnata e sigillato in un sacchetto di plastica a 4 ° per diverse settimane.
16. Per ulteriori analisi, blocchi di agar contenente coppia di barbigli può essere tagliato fuori dal gel con una lama di bisturi o un rasoio e trattati per istologia paraffina o criosezionamento con metodi standard di ^3,4. In alternativa, barbi individuo può essere sezionato dalla agarosio con aghi sottili, lavate in acqua, e trattati per altre applicazioni a valle (ad esempio, con tutto il montaggio immunoistochimica e microscopia confocale).

Discussione

Il pesce zebra mascellare barbi è un sistema di tessuto sottoutilizzate per lo studio della crescita, la manutenzione e la rigenerazione di diversi tipi di cellule in zebrafish. Anche se l'appendice barbi non ha l'analogo umano, i tipi di cellule in esso contenute sono altamente conservati, rendendo possibile lo studio della pelle, ghiandole, melanociti, vasi circolatori e nervi in ​​una struttura otticamente chiara e anatomicamente semplice forma cilindrica. Simile al ben studiato pinna caudale, il tessuto barbi possono essere indotte a rigenerare da amputazione. Utilizzando il bordo della mascella come un punto di riferimento anatomico, il piano di amputazione può essere collocato con precisione, agevolare la misurazione dei barbi ricrescita. Per un operatore esperto, ogni intervento chirurgico richiede solo pochi secondi. Il recupero è rapido, e finora abbiamo rilevato alcun effetto a breve oa lungo termine sul comportamento dei pesci. Zebrafish con una nuotata mascellare barbi, mangiano e si riproducono nel modo più efficace non chirurgica controlli, e hanno la sopravvivenza paragonabile al momento della raccolta dei tessuti, fino a 6 mesi dopo l'intervento chirurgico. L'impatto fisiologico di questo intervento chirurgico previsto per essere minimo, perché 1) le papille gustative extraorali trasportati sulla barbi si trovano anche in molte altre parti del dell'epitelio pesci, tra cui le labbra, le guance e la testa ^5, e 2) papille gustative di differenziazione appaiono il barbo rigenerante entro 72 ore (LeClair et al., dati non pubblicati). Questo rende il mascellare barbi un sistema mini-invasivo per studiare la guarigione delle ferite, rivascolarizzazione, e reinnervazione nel contesto di un vertebrato adulto.

Dopo l'induzione chirurgica della rigenerazione, barbi possono essere raccolti ad intervalli per la misurazione morfometrica e / o l'analisi microscopica dei tessuti fissi. Per comodità, il mascellare barbi è circa la lunghezza (2-3 mm) e diametro (100-200 mm) di un embrione di pesce zebra, facilitando l'applicazione di molti protocolli standard, tra cui l'istologia paraffina, criosezionamento, con tutto il montaggio immunoistochimica, ed in situ ibridazione. Prese insieme, queste caratteristiche rendono il mascellare barbi altamente fattibile modello in vivo per studiare la riparazione dei tessuti e la rigenerazione.

Materiali

Microscopio Attrezzature

Un microscopio stereo con dissezione trasmessa e incidente in fibra ottica di illuminazione è necessaria per clipping barbi e l'incorporamento di agar.

Barbel Clipping

• Pesce sistema idrico
• 2 zebrafish incrocio serbatoi
• MS-222 (3-etil amminobenzoato metanosolfonato; chimica Sigma # E10521-10G)
• sterili da 120 mm piastra Petri
• tovaglioli di carta bagnati
• spatola metallica smussata
• Dumont # 55 Bio Inox Pinza (Strumenti Scienza Belle # 11255-20)
• Mini-Vännäs molla forbici (Strumenti Scienza Belle # 15000-00)
• blu di metilene agente antimicotico (Dott. Foster & Smith # CD-905781)
• piccolo acquario a rete

Raccolta dei tessuti e l'incorporamento di agar

• Paraformaldeide 4% in 1x PBS (PF-PBS), fino aliquotati in 50 mL conica e congelati a -20 ° C usare
• 1x PBS (pH 7,27-6)
• 250 ml di vetro fiasco
• Agarosio al 2% in acqua distillata
• standard di piccole gel elettroforesi su rig (dimensioni del gel = ~ 10 cm quadrati)
• piccolo campione pettine a denti elettroforesi (pettine formato 4 x 1,5 mm)
• acqua bagno caldo (50-60 ° C)
• laboratorio nastro
• nero smaltato perni insetti, dimensioni 000 (Strumenti di scienze Belle # 26000-25)
• 1-2 titolari pin (strumenti Scienza Belle # 26016-12)
• Da 9 pollici in vetro pipetta Pasteur
• pipetta a bulbo o della pompa
• laboratorio di tessuti
• etichette di carta di piccole
• (Opzionale) scala di calibrazione stampato
• tovaglioli di carta bagnati
• zip di chiusura sacchetto di plastica
• bisturi / lama di rasoio (per tagliare blocchi di agar)