Una tecnica di visualizzare contemporaneamente Virus specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus In situ</em

Summary

Una tecnica che combina in colorazione tetramero situ e di ibridazione in situ (ISTH) consente la visualizzazione, la mappatura e l'analisi della vicinanza spaziale del virus-specifiche cellule T CD8 + ai loro infettati da virus obiettivi, e la determinazione delle relazioni quantitative tra questi effettori immuni e gli obiettivi ai risultati infezione.

Abstract

I numeri e le posizioni dei virus-specifiche cellule T CD8 + rispetto al numero e le posizioni dei loro obiettivi di cellule infette è pensato per essere critico nel determinare gli esiti che vanno dalla distanza di infezioni croniche persistenti. Descriviamo qui un metodo per valutare le relazioni spaziali e quantitative tra immunitarie effettrici (E) del virus-specifiche cellule T CD8 + e target infetti (T), che combina in situ tetramero (IST) colorazione per rilevare virus-specifiche cellule T CD8 + e in situ ibridazione (ISH) per rilevare virus-RNA + cellule nei tessuti dove la battaglia tra le difese immunitarie e l'infezione ha luogo. La combinazione di colorazione TSI e ISH, abbreviato ISTH, consente la visualizzazione e la mappatura dei luoghi di cellule immunitarie effettrici e gli obiettivi, determinazione e facile di E: T ratio. Questi parametri, a loro volta possono poi essere utilizzati per determinare le relazioni tra prossimità spaziale, e la tempistica e l'ampiezza della risposta immunitaria in grado di predire gli esiti di infezione precoce.

Protocol

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Li et al. Science 323, 1726-1729 (2009) .

Combinati in colorazione tetramero situ ed in situ di ibridazione (ISTH) procedure

Procedure ISTH può essere diviso in 4 fasi: 1) colorazione IST di antigene-specifiche cellule CD8 + T nei tessuti, 2) ISH per rilevare infettati da virus-RNA + cellule; 3) confocale di immagini microscopiche delle TSI macchiati di cellule e virus-RNA + cellule; 4) analisi delle immagini, compresa la costruzione di montaggi di immagini e mappatura delle tetramero + e virus a RNA + cellule.

1. Colorazione della TSI antigene-specifiche cellule T CD8 + in sezioni di tessuto.

1. Tagliare i tessuti freschi in 200 sezioni um di spessore utilizzando un vibratome o bisturi.
2. Freddo bagno vibratome con PBS sterile-H e freddo a 0-2 ° C. Impostare l'angolo vibratome lama ad una piuttosto ripido 27 °. Quando possibile, mantenere i tessuti raffreddata in ghiaccio al fine di minimizzare la degradazione. Tessuto fresco è anche più facile la sezione con un vibratome quando è freddo.
3. Taglio del tessuto con le forbici o bisturi chirurgico in piccole largo circa 0,5 centimetri dello 0,25 pezzi cm di altezza. Mettete i pezzi di tessuto in una pesa barca o piccolo piatto e coprire con ~ 40 ° C fuso PBS 4% tamponata bassa temperatura di fusione agarosio. Assicurarsi che il tessuto è in contatto con il fondo del piatto. Spingere verso il basso i pezzi di tessuto che galleggino. Solidificare su ghiaccio. Questo richiede di solito 3-5 minuti.
4. Cappotto vibratome blocco di tessuto con la colla Loctite. Tagliare agarosio intorno al tessuto con un bisturi, e quindi utilizzando una pinza, trasferire accuratamente il tessuto fragile agarosio incorporato ad un blocco vibratome rivestito in colla. Non spostare il pezzo di tessuto una volta che è impostato sul blocco dei tessuti. Lasciare asciugare circa 10 minuti in ghiaccio.
5. Montare blocco di tessuto nel vibratome e tagliare il tessuto in 200um sezioni spesse con un morto a bassa velocità in avanti e ampiezza relativamente alta. Impostazioni di velocità e ampiezza varia con ogni vibratome. Se un vibratome non è disponibile, o il tessuto non è suscettibile di vibratome sezionare, tagliare i tessuti a strisce sottili utilizzando un bisturi.
6. Trasferire le sezioni con un pennello in una camera tessuto situato nel pozzetto di una 24-pozzetti di coltura contenente 1 ml di acqua refrigerata PBS-H. Mettere un massimo di quattro sezioni di tessuto in ciascuna camera dei tessuti. Etichettare il coperchio della piastra di coltura con informazioni sui campioni sperimentali e coperchio sicuro alla piastra con un elastico.
7. In alternativa, per i tessuti che non tagliano bene con vibratome, come intestino, può tagliare il più sottile possibile con strisce lama di bisturi o un rasoio. Mettere una sola sezione per bene per sezioni tagliate bisturi.
8. Procedere alla colorazione subito dopo finito il taglio dei tessuti. Tenere sezioni refrigerate a minimizzare il degrado in ogni momento fino fissi. Non lasciare asciugare sezioni. Mantenere sezioni in refrigerata PBS sterile-H.
9. Incubare le sezioni di tessuto per tutta la notte con 0,5 mg / ml tetrameri coniugato con FITC. Può includere il mouse o non coniglio anticorpi diretti a epitopi extracellulari in questa incubazione, ad esempio, gli anticorpi anti-CD8, diluito 1:200 in blocco soluzione. Usare 1 ml di soluzione per ogni bene per questo e per tutte le incubazioni successive ed eseguire questo e tutte le successive incubazioni a 4 ° C con piastre su una piattaforma oscillante. Tenere camere di tessuto contenente diversi campioni sperimentali separati da almeno un pozzo vuoto per evitare la contaminazione incrociata di soluzioni nei passaggi successivi.
10. Dopo l'incubazione primaria, lavare sezioni con PBS freddo-H due volte (2X) per 20 minuti ciascuno. A tale scopo, trasferendo le camere tessuto a un altro di 24 e piastra di coltura contenente refrigerata PBS-H. Fare attenzione a non sgocciolare il contenuto da un campione sperimentale in un altro, quando ci si sposta camere di tessuto. Per tutte le incubazioni e lavaggi successivi allo stesso modo il trasferimento alle camere dei tessuti di un piatto pulito contenente la soluzione appropriata. Monitor sezioni in camere di tessuto durante la procedura per assicurarsi che le sezioni non rimanere bloccato ai lati delle camere di tessuto.
11. Sezioni fissare con PBS fresco tamponata al 4% paraformaldeide per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare con PBS freddo-H 2X 5 minuti ciascuno.
12. Incubare con coniglio anti-FITC anticorpi, ad esempio Biodesign1: 10.000, nel bloccare soluzione per 1-3 giorni. Per il co-etichettatura, possono includere non coniglio anticorpi diretti a epitopi intracellulare in questa incubazione pure. Per questa opzione, espongono epitopi se necessario, e permeano e bloccare le cellule prima della seconda incubazione.
13. Se gli anticorpi con la regia di epitopi intracellulari che richiedono il recupero dell'antigene dalla fissazione di formaldeide, espongono epitopi facendo bollire 3 volte in Urea 0.01M, 10 secondi ogni volta, in un forno a microonde. Attendere 2 minuti tra ogni riscaldamento. State molto attenti come soluzione bollente può forzare le sezioni fuori dei pozzetti. In questo caso, utilizzare un pennelloper spingere sezioni dai lati della camera di tessuto o dal coperchio della piastra posteriore nella parte inferiore della camera di tessuto appropriati. Se gli anticorpi non richiedono il recupero dell'antigene omettere questo passo.
14. Se si utilizza anticorpi diretti a epitopi intracellulare, prima della seconda incubazione, permeabolize e bloccare le cellule nelle sezioni di tessuto con PBS-H contenente 0,3% Triton X-100, e 2% di siero normale di capra per un'ora. Quindi eseguire incubazioni anticorpi rimanenti in PBS-H contenente 0,3% Triton X-100 e 2% siero di capra normale.
15. Dopo la seconda incubazione, lavare sezioni in PBS-H per 20 minuti a diverse ore. Ripetete due volte per un totale di tre lavaggi. Eseguire una incubazione finale con appropriati anticorpi fluorescente. Per esempio, capra anti-coniglio-Cy3 e capra anti-topo-Alexa 488 diluito 1:1000 nel bloccare ogni soluzione. Incubare per 1-3 giorni. Tenere sezioni protette dalla luce, avvolgendo le piastre in carta stagnola in questa incubazione e, successivamente, come la luce fluorofori spegne.
16. Lavare le sezioni in PBS-H per 20 minuti a diverse ore. Ripetete due volte per un totale di tre lavaggi.
17. Per TSI combinato con ISH post-fix sezioni di post-fix in paraformaldeide 4% per 1 ora a tetrameri sicuro e gli anticorpi a posto, quindi risciacquare sezioni con PBS-H di nuovo e montare.
18. Utilizzare un pennello per trasferire sezioni ad un vetrino da microscopio. Cappotto ogni sezione con glicerolo / gelatina contenenti 4mg/ml n-propil gallato o altri supporti di montaggio che contiene un conservante fluoroforo e coprire con un coprioggetto. Conservare i vetrini a luce contenitore scivolo protetta a -20 °. Sciacquare piastre di coltura dei tessuti e rimuovere le etichette sui coperchi con l'alcol. Possibile riutilizzare piatti.
19. Analizzare sezioni di tessuto colorato con un microscopio confocale. Poi può procedere ISH.

2. Rileva infettati da virus-RNA + cellule ibridazione in situ.

Questo nel protocollo ibridazione in situ è stato modificato dalla nostra protocolli precedentemente pubblicato con il ^4,5 come segue:

1. Re-cut 5-8-micron di spessore-sectionss di spessore in situ sezioni colorate tetramero.
   1. 200-micron di spessore-sezioni sono riscaldate a 70 ° C per 5 minuti per staccare la sezione dalla diapositiva.
   2. La sezione è poi incorporato in ottobre in ghiaccio secco.
   3. 8-micron sezioni sono tagliate con un criostato dalle sezioni di spessore e aderito alle diapositive silanizzata.
   4. Le diapositive possono essere conservati a -80 ° C in una scatola sigillata per la successiva ibridazione in situ.
2. Ibridazione in situ
   1. Reidratare le sezioni di tessuto immergendo i vetrini per 3 minuti ciascuna nel 90% di etanolo e DEPC-acqua trattata.
   2. Permeabilize sezioni di tessuto con il riscaldamento in tampone citrato 10mM (pH 6,0) a 98 ° C a bagnomaria per 15 minuti.
   3. Sezioni di tessuto fresco a temperatura ambiente per 20-30 min.
   4. Lavare due volte in DEPC trattati con acqua per 3 minuti.
   5. Acetilato sezione di tessuto immergendo scivola di 0,25% anidride acetica a 0,1 M TEA (trietanolammina, pH8.0) per 10 min.
   6. Trasferimento diapositive in 0,1 TEA M (pH8.0) per 5 min.
   7. Ibridare sezioni a ³⁵ S-etichettati virus-specifici (come l'HIV-1, SIV) sonda antisenso o senso (controllo negativo per l'HIV-1, SIV), o ³⁵ S-etichettati riboprobes LCMV (pooled senso e antisenso).
   8. Lavare due volte con sezioni 2xSSC per 5 minuti dopo ibridazione overnight a 42 ° C.
   9. Lavare le sezioni in STE (0,5 M di NaCl, 1mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) per 5 min.
   10. Digest sezioni con RNasi A e T1 in STE a 37 ° C per 30 minuti
   11. Lavare le sezioni in 2x SSC più 50% formammide per 5 min.
   12. Lavare le sezioni in 1x SSC 10 min.
   13. Lavare le sezioni in SSC 0,5 x 15 min.
   14. Disidratare sezioni in 70, 80 e 100% di etanolo contenenti 0,3 M di acetato di ammonio, ogni 5 minuti.
   15. Sezioni cappotto con emulsione nucleare pista
   16. A secco in una stanza buia per 1 ora.
   17. Esporre sezioni a 4 ° C per 11 giorni (SIV) e 3 giorni (LCMV).
   18. Sviluppare le sezioni in D19 (Kodak, Cat # 146 4593) per 3 minuti, lavare in dH2O 30 secondi, fissare a Rapid Fixer (Kodak, Cat # 146 4106) per 4 minuti, lavare in dH2O 5 min x 3 volte.
   19. Disidratare nel 70%, 80% ed etanolo assoluto, a 5 minuti ciascuno.
   20. Diapositive montare in fluorescenti medio Permount compatibili.

3. Acquisire immagini al microscopio confocale.

1. Catturare immagini ISTH con un Bio-Rad microscopio confocale MRC 1000, o qualsiasi altro microscopio confocale con Epi2-Blue dispositivo di riflessione.
2. Usa Epi1-605 per il tetramero fluorocromo rosso, Epi2 DF32-522 per il verde CD8 fluorocromo, e la Epi2-Blue riflessione per grani d'argento (segnale ISH nel radioautographs sviluppato) a 20x (per i SIV) o 60x (per LCMV)
3. Sequenzialmente raccogliere Z-serial immagini a intervalli di 1-micron nei tre canali di ogni campo.
4. Acquisire immagini da ogni sezione da sinistra adestra e dall'alto verso il basso, e il nome ogni immagine in base alla sua riga e di colonna in un file di Excel.
5. Catturare ogni immagine con una sovrapposizione ~ 20% con le sue immagini vicine al fine di evitare lacune nella immagine ricostruita montaggio.

4. Analisi di immagine: ricostruzione dell'immagine montaggio, il calcolo e l'analisi delle cellule baricentro spaziale.

1. Progetto Z-serial immagini in una sola immagine per ogni canale con l'assistente confocale (versione 4.02.).
2. Unisce automaticamente l'immagine proiettata da tre canali in un'unica immagine RGB, utilizzando una procedura d'azione Photoshop 7.0.
3. Generare un'immagine montaggio cucendo immagini fuse insieme a strati in Photoshop 7.0.
4. Associato grani d'argento individuale e tetramero macchia con le cellule, e assegnare le coordinate X, Y dei centri (centroidi) dell'RNA SIV + e cellule tetramero +, usando MetaMorph (versione 7.1.3.) O Photoshop (disponibile presso l'autore)
5. Esportare i dati in file Excel centroide come numeri numerico per ogni cella. E: T rapporti sono determinati dai file Excel dal numero totale di tetramero + e + RNA virale delle cellule nella sezione.

Relazioni spaziali tra il rosso e il blu tetramero + SIV RNA + cellule vengono catturati da copiare e incollare le loro trame rispettive dai file Excel in un documento Photoshop. Dopo essere diminuita l'opacità di uno strato di allineare e scala le griglie in modo che essi coincidono, colore-selezionare e copiare e incollare in un nuovo livello le posizioni dei blu RNA + celle e quindi scartare lo strato utilizzato per allineare le griglie, le posizioni del tetramero + + e l'RNA virale delle cellule sarà rivelato a immagine appiattita.

5. Note aggiuntive

Se il taglio dei tessuti infettive:

Lavoro in un laboratorio BSL2.5. Prendere precauzioni speciali con lame di rasoio. Mettere il rasoio nella lama vibratome montare con una pinza. Se non è possibile mettere la lama con una pinza, poi metterla in prima di aggiungere tessuto al bagno, e non sostituiscono la lama. Quando si taglia finito, rimuovere la lama con una pinza. Lama a spruzzo con il 70% EtOH o DMQ prima della rimozione. Come sempre, gettare in un contenitore lame taglienti. Cambiare i guanti esterni o risciacquare con disinfettante dopo ogni contatto con i tessuti o PBS contaminati nel serbatoio. Al termine, se si lavora con materiale infettivo, aggiungere disinfettante DMQ al PBS nel serbatoio e lasciate riposare un paio di minuti prima di rimuovere. Smaltire decontaminati PBS giù per lo scarico. Risciacquare il serbatoio con acqua per eliminare il sale e disinfettante. Pulire gli utensili di lavoro e con DMQ. Lavare gli utensili con acqua.

Fare tetrameri da biotinilato monomeri MHC:

Biotinilato ottenere molecole MHC di classe I, come HLA-A * 0201 / B ₂ m / molecole peptidiche prodotte sia con Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV), o irrilevanti MART peptide (ELAGIGILTV) peptidi da Beckman Coulter. Biotinilato HLA-A * 0301 / B ₂ m / molecole peptidiche prodotte sia con Gag (KIRLRPGGK) o Nef (QVPLRPMTYK) presso l'impianto di tetramero NIAID. Tetrameri sono generati con l'aggiunta di 6 aliquote di marcato con FITC ExtraAvidin (Sigma) biotinilato Mamu A * 01 / B ₂ m / monomeri di peptide nel corso di 8 ore per un rapporto finale molare di 4.5:1. La logica alla base aggiungendo la Extravidin sta lentamente che durante i primi punti di tempo c'è una sovrabbondanza di monomero che assicura che tutti i Extravidin aggiunto riceve tutti e quattro i siti legati biotina. Più tardi nella reazione, questo processo è meno efficiente perché c'è meno monomero a sinistra e più di una possibilità che ExtrAvidin non avranno tutti e 4 i siti legati. Se aggiunti tutti i ExtrAvidin subito la reazione sarebbe stata meno efficienti e più molecole Extravidin avrebbe solo 2 o 3 monomeri collegato.

Discussion

Dal virus a RNA è usata come marcatore per le cellule infettate dal virus in questo rapporto, tutti i reagenti prima di ibridazione dovrebbe essere RNAase libero. La procedura di ibridazione in situ qui descritta è stata modificata per preservare il segnale fluorescente dalla colorazione tetramero in situ. Poiché il segnale radioautographic da virus infetti le cellule rilevato da ibridazione in situ è ​​ad una profondità di circa un diametro di cellule, le sezioni spessa utilizzata per la colorazione tetramero in situ devono essere ritagliato in 5-8-micron di spessore sezioni.

Questa nuova tecnica di combinare in tetrameri situ e di ibridazione in situ (ISTH) qui descritto consente la visualizzazione simultanea, mappatura e analisi del rapporto spaziale del virus-specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus bersaglio. Questo metodo può essere applicato per la valutazione delle cellule CD8 + vaccino a base T e in altri non-virus patogeno e le interazioni ospite. Il metodo di analisi delle immagini qui descritto può anche essere adattato per studiare le relazioni spaziali di due popolazioni di cellule che interagiscono in situ, ad esempio, abbiamo recentemente utilizzato la procedura centroide mappatura nello studio del virus HIV-1 la trasmissione sessuale nel modello dei primati non umani di immunodeficienza delle scimmie infezione da virus di macachi rhesus ⁶

Materials