Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

Sommario

Una metodologia per isolare ad alto peso molecolare del DNA genomico e di alta qualità da parte della comunità microbica del suolo è descritta.

Abstract

Il microbioma suolo è un vasto serbatoio e relativamente inesplorato della diversità genomica e innovazione metabolici che è intimamente associato a sostanze nutritive e flusso di energia negli ecosistemi terrestri. Coltivazione indipendente genomica ambientale, noto anche come metagenomica, approcci promessa accesso senza precedenti a queste informazioni genetiche rispetto alla ricostruzione percorso di screening e funzionale a fini terapeutici ad alto valore e processi di conversione della biomassa. Tuttavia, il microbioma suolo rimane ancora una sfida in gran parte dovuta alla difficoltà di ottenere DNA di alta peso molecolare di qualità sufficiente per la produzione di grandi biblioteche inserire. Qui introduciamo un protocollo per l'estrazione ad alto peso molecolare, DNA genomico comunità microbica da terreni e sedimenti. La qualità del DNA genomico isolato è ideale per la costruzione di grandi librerie di inserimento ambientale genomiche per applicazioni a valle di sequenziamento e di screening.

La procedura inizia con la lisi cellulare. Pareti delle cellule e le membrane dei microbi vengono lisati da entrambe le forze meccaniche (rettifica) e chimici (β-mercaptoetanolo). Il DNA genomico viene poi isolato tramite tampone di estrazione, cloroformio-alcool isoamilico e alcool isopropilico. I tamponi utilizzati per la lisi e fasi di estrazione comprendono isotiocianato di guanidina e esadeciltrimetilammonio bromuro (CTAB) per preservare l'integrità del DNA genomico ad alto peso molecolare del peso. A seconda dell'applicazione a valle, il DNA genomico isolato può essere ulteriormente purificato con cloruro di cesio (CsCl) ultracentrifugazione gradiente, che riduce le impurità tra cui gli acidi umici. Il primo procedimento, l'estrazione, dura circa 8 ore, escluse le passo la quantificazione del DNA. L'ultracentrifugazione gradiente di CsCl, è un processo di due giorni. Durante l'intera procedura, il DNA genomico deve essere trattata con delicatezza per evitare di taglio, evitare vortex severo, duro e ripetitivo pipettaggio.

Protocollo

Parte I: Estrazione del DNA

Procedura

1. 8 ore sono tenuti, per l'elaborazione di 6 campioni esclusi quantificazione del DNA.

Prima di iniziare l'estrazione, sarà necessario pre-chill mortaio, pestello e spatola in un congelatore di -20 ° C o con azoto liquido. Inoltre, pre-chill 50 ml provette contenenti 20 ml di cloroformio alcool isoamilico (24:1) su ghiaccio. Impostare il forno di ibridazione a 65 ° C per preriscaldare. Controllare soluzione CTAB, se è cristallizzato calda a 60 ° C per sciogliere i cristalli. Completa la soluzione tampone di estrazione de....

Materiali

Ricetta

* Denaturazione soluzione
4 M guanidina isotiocianato
10 mM Tris-HCl (pH 7,0)
1 mM EDTA
0,5% 2-mercaptoetanolo

Soluzione di denaturazione: 10 ml in totale
Guanidina isotiocianato (118,16 MW)	4,73 g
1M Tris-HCl (pH 7,0)	100 ul
0.5M EDTA	20 l
Aggiungere acqua a 9,95 ml in totale.
Autoclave.
Aggiungere 50 microlitri 2-mercaptoetanolo appena prima dell'uso. (5 ml di 2-mercaptoetanolo per 1 ml Soluzione di denaturazione) Nota: Conservare la soluzione di denaturazione a 4 ° C. Non utilizzare buffer di più di una settimana. Se possibile, fare tampone fresco da usare.

** Tampone di estrazione
100 mM di tampone fosfato di sodio [pH 7,0]
100 mM Tris-HCl [pH 7,0]
100 mM EDTA [pH 8,0]
1,5 M di NaCl
Bromuro di esadeciltrimetilammonio 1% (CTAB)
2% SDS

Tampone di estrazione per 1 L in totale
Tampone fosfato di sodio 1M [pH 7,0] *	100 ml
1M Tris-HCl [pH 7,0]	100 ml
0.5M EDTA [pH 8,0]	200 ml
5 M NaCl	300 ml
Autoclave e tenerlo a temperatura ambiente.
Aggiungere 200 ml, il bromuro di esadeciltrimetilammonio 5% (CTAB, autoclavato) e 100 ml, 20% SDS (autoclave) subito prima dell'uso. Se CTAB è stato cristallizzato, si fondono a 60 ° C. * 1M tampone fosfato di sodio: 57,7 ml di sodio 1M fosfato monobasico (NaH 2 PO 4) e 42,3 ml, 1M Fosfato di sodio bibasico (NaH 2 PO 4). Regolare il pH a 7,0 Nota: non utilizzare il 20% SDS se è precipitazioni. E 'normale vedere sospensione lattiginosa quando si aggiunge SDS alla soluzione. Una volta aggiunto SDS, posizionare il tampone di estrazione a 60 ° C per assicurare SDS è ben sospeso.