In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la purificazione di Drosophila Neuroni periferici utilizzando un digiuno perla magnetica assistita strategia di separazione delle cellule. RNA ottenuti da cellule isolate possono essere facilmente utilizzato per applicazioni a valle comprese le analisi di microarray.
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Articolo metodologico
Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead
In questo articolo
Sommario
Protocollo
Commenti generali su Magnetic Ordinamento Bead della Drosophila neuroni periferici (Timing totale per il completamento del protocollo: 2,5-3 ore)
Procedure standard di laboratorio per il mantenimento di un ambiente pulito e libero RNAse devono essere osservate in ogni momento per evitare la degradazione dell'RNA.
Quando la cuticola larvale Drosophila viene sezionato e posto nel buffer di dissociazione delle cellule, i neuroni periferici sono una delle celle ultima a staccarsi dalla cuticola. Abbiamo sfruttato questa proprietà e progettato questo protocollo per rimuovere la maggior parte d....
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Discussione
Il protocollo presentato qui è ottimizzato per l'isolamento e la purificazione dei neuroni periferici che aderiscono strettamente alla superficie interna della cuticola terzo Drosophila instar larvale con una perla magnetica strategia di separazione delle cellule. Mentre abbiamo usato questo protocollo per isolare specificamente Drosophila neuroni da applicazioni di questo protocollo per l'isolamento di altri tipi di cellule che aderiscono alla cuticola in stadi larvali o pupe di sviluppo (per esempio epiteli, m.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo Drs. Yuh-gen Nung e Wes Grueber per la fornitura di scorte di volo utilizzato in questo studio. Gli autori riconoscono la F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust per il supporto di questa ricerca (DNC) e l'Ufficio George Mason University Provost (EPRI).
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Materiali
Attrezzatura
- (10) blocco magneti al neodimio (Magnetics K & J, Inc., cat. # B444B), in alternativa DynaMag ™ -2 (Invitrogen, cat. N. 123-21D), può essere utilizzato.
- Kontes Grinder tessuto di vetro, 2 ml di lavoro, con pestello spazio di grandi dimensioni (Cat. # 885300-0002)
- Filtri di cellule, ad esempio, MACS pre-filtro di separazione (Miltenyi Biotec, cat. # 130-041-407)
- 35 millimetri petri-piatti rivestiti con Sylgard (Dow Corning Corporation, cat. # 3097358-1004)
- Strumenti di dissezione: due paia di pinzette Dumont n. 5 (Strumenti Scienza Fine, Cat # 11251-20).
- Vännäs primavera micro-dissezione forbici (Strumenti Scienze Arti, cat. # 15000-08)
- Pipette (P-1000, P-100, P-10) con punte monouso
- Emocitometro standard per contare le cellule e la purezza stima
- Pipette Pasteur con punte fuoco lucido di diametro standard, ridotto a circa il 50% del diametro standard e ridotto a ~ 25% del diametro standard per la triturazione
- Piano micro-centrifuga (1-16,000 (x) g)
- Vortice
- Fluorescente stereo-microscopio (un MZ16FA Leica è stato utilizzato in questo protocollo)
Riferimenti
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling o....
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Ristampe e permessi
