In questo articolo andremo a descrivere il procedimento per determinare coefficienti di diffusione multi-fotone con il recupero di fluorescenza dopo photobleaching. Inizieremo allineando il laser lungo il percorso ottico al campione e determinare i parametri corretti sperimentale, poi continuare a generare ed infine montaggio curve recupero fluorescenza.
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Articolo metodologico
Misurare coefficienti di diffusione via a due fotoni di recupero fluorescenza Dopo photobleaching
In questo articolo
Sommario
Abstract
Multi-fluorescenza recupero dopo photobleaching è una tecnica di microscopia utilizzato per misurare il coefficiente di diffusione (o parametri di trasporto analoghe) delle macromolecole, e può essere applicato sia
Protocollo
1. Allineare l'ottica.
L'attrezzatura fondamentale per un MP-FRAP esperimento comprendono: un modo bloccato sorgente laser, Cell Pockels (per la modulazione del fascio), generatore di impulsi, dicroici, lenti dell'obiettivo, emissione di fluorescenza filtro, tubo fotomoltiplicatore recintato, e un sistema di registrazione dei dati (fotoni contatore e multicanale scaler).
2. Determinare i poteri del monitor di sicurezza.
- Attenuare il laser ad un basso, ma ragionevole, il potere di generare fluorescenza all'interno del campione.
- Messa a fuoco all'interno del campione.
- Impostare un co....
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Discussione
La potenza del multi-fotone recupero di fluorescenza dopo photobleaching risiede nella sua capacità di sondare i campioni di spessore con risoluzione 3D. Dal momento che il suo sviluppo nel 1990, MP-FRAP è stato utilizzato per determinare il coefficiente di diffusione (o parametri di trasporto analoghe) in corpi cellulari, ex fette di tessuto vivo di spessore, e nel tessuto vivo e nell'interstizio. In questo articolo, abbiamo presentato l'attrezzatura necessaria per eseguire u.......
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da un Dipartimento di Era Difesa del Premio Speranza Scholar (n. W81XWH-05-0396) e un Scholar Pew al Premio Scienze Biomediche a Edward B. Brown III.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Laser a Ti:sapphire | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Cella di Pockels | Conoptics | 350-80 | |
| Microscopio a scansione laser | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Specchio dicotroico passa-basso | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Fotomoltiplicatore | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Contatore di fotoni | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Scalatore/mediatore multicanale | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Generatore di impulsi | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
Riferimenti
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.
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Ristampe e permessi
