Un multi-parametrica Perifusion Sistema isolotto all'interno di un dispositivo Perifusion Microfluidic

Summary

Un dispositivo microfluidic perifusion isolotto è stato sviluppato per la valutazione della secrezione insulinica dinamica di isole multiple e simultanee imaging di fluorescenza di afflusso di calcio e mitocondriale potenziali cambiamenti.

Abstract

Un dispositivo microfluidic perifusion isolotto è stato sviluppato per la valutazione della secrezione insulinica dinamica di isole multiple e simultanee imaging di fluorescenza di afflusso di calcio e mitocondriale potenziali cambiamenti. Il dispositivo è costituito da tre strati: primo strato contiene un array di microscala pozzi (500 micron di diametro e 150 micron di profondità) che aiutano a immobilizzare le isolette, mentre esposto al flusso e massimizzare la superficie esposta delle isole, il secondo strato contiene una circolare perifusion camera (3 mm di profondità, 7 mm di diametro) e il terzo strato contiene un ingresso di miscelazione dei canali che i fan prima dell'iniezione nella camera perifusion (2 mm in larghezza, 19 mm di lunghezza e 500 micron di altezza) per l'ottimizzazione l'efficienza di miscelazione prima di entrare nella camera di perifusion. La creazione di gradienti di glucosio diverse tra cui una lineare, forma a campana, e forme squadrate può anche essere creato nella rete perifusion microfluidica ed è dimostrato.

Protocol

Microfabrication A. di 3-strati dispositivo perifusion microfluidica

Bene fondo Maestro protocollo (150 micron pozzi profondi)

1. Pulire le fette che utilizzano una lama di rasoio, se necessario. Pulire con acetone, metanolo, e IPA. Eseguire il trattamento al plasma a 50 Watt per 30 secondi
2. Spin SU8-100 @ 2000 rpm. [Fase 1: 500 giri, 10 s, 100 giri / s, Fase 2: 2000 rpm, 30 s, 300 giri / s].
   [NOTA: non tenere il wafer con una pinzetta dopo filatura SU8]
3. Morbido cuocere il wafer a 65 ° C per 20 min e 95 ° C per 50 min.
4. Il wafer viene esposto alla luce UV attraverso una maschera desiderata. Dose per 150 micron altezza è di 650 mJ / cm ^2.
5. Post-esposizione cuocere il wafer a 65 ° C per 1 minuto e 95 ° C per 12 min.
6. Sviluppare il wafer in SU8 sviluppatore per 15 min.

Microcanali Maestro protocollo (500 micron pozzi di profondità)

1. Pulire le fette che utilizzano una lama di rasoio, se necessario. Pulire con acetone, metanolo, e IPA. Eseguire il trattamento al plasma a 50 Watt per 30 secondi
2. Spin SU8-2150 @ 1000 rpm. [Fase 1: 500 giri, 10 s, 100 giri / s, Fase 2: 1000 rpm, 30 s, 300 giri / s].
3. Morbido cuocere il wafer a 65 ° C per 15 minuti e 95 ° C per 2 ore e 30 min.
4. Il wafer viene esposto alla luce UV attraverso una maschera desiderata. Dose di esposizione per 650 micron altezza è 685 mJ / cm ^2.
5. Post-esposizione cuocere il wafer a 65 ° C per 5 minuti e 95 ° C per 35 min.
6. Sviluppare il wafer in SU8 sviluppatore per 20-30 min.

PDMS soluzione di preparazione

1. Polidimetilsilossano (PDMS) soluzione viene preparata mescolando accuratamente da 10 parti di elastomeri di silicone con 1 parte di catalizzatore di un kit standard Sylgard 184.
2. Le bolle generate nella soluzione PDMS durante il processo di miscelazione vengono rimossi con un essiccatore a vuoto.
3. La bolla senza soluzione di PDMS sta lentamente erogato sulla SU8 maestri e un piatto vuoto Petri per il terzo strato.
4. La temperatura della piastra è impostato a 75 ° C e il PDMS è curata a questa temperatura per 2 ore
5. Insenature, prese e pozzi di cambio sono perforati utilizzando l'apposito perforatrice dimensioni.
6. Gli strati sono legati insieme su un vetrino (dimensioni 0,1 mm) utilizzando un dispositivo palmare plasma.

B. Apparato Sperimentale

1. Etanolo al 70% del flusso attraverso la micro-dispositivo per la sterilizzazione. DI flusso d'acqua per lavare l'etanolo. Profumato 50 ml di BSA 0,5% attraverso il dispositivo per evitare l'adsorbimento non specifico di insulina alle pareti microcanali.
2. La rampa di pendenza di glucosio e di altre pendenze legate generati dal software LabVIEW che comunica con la siringa sono testati pompe per assicurarsi che le pendenze sono stabili.
3. 25-30 isolotti topi sono stati incubati con 5 Fura-2/AM mM (un indicatore di calcio, sonde molecolari, CA) e 2,5 mM rodamina 123 (Rh123, un indicatore potenziale mitocondriale, Sigma, MO) per 30 minuti a 37 ° C in Krebs-Ringer buffer (KRB) contenente 2 glucosio mM
4. Gli isolotti topi vengono attentamente pipettati nel dispositivo perifusion microfluidi attraverso la porta di entrata.
5. La rete è l'installazione della microfluidica collegando l'ingresso alle pompe siringa usando tubi Tygon e di un connettore a Y e la presa di raccoglitore di frazioni. Il dispositivo si siede su una fase di riscaldamento (37 ° C) sul microscopio e il tubo di aspirazione viene riscaldata su una piastra per mantenere la temperatura della camera e la soluzione a 37 ° C.
6. Immediatamente dopo l'installazione, gli isolotti topi sono perifused con KRB contenente 2 mM glucosio per 10 minuti e poi una rampa di glucosio (2mm 25mm) per 25 min.
7. Time-lapse immagini vengono raccolti e analizzati ogni 15 s da un software SimplePCI. Il perifusate è anche raccolto ogni minuto usando un raccoglitore di frazioni di analizzare alla secrezione insulinica mediante il kit ELISA.

Rappresentante Risultati

Isolotti del mouse sono stati perifused con una sfumatura lineare di 2-25 mM glucosio. Come mostrato nella Figura 1, afflusso di calcio e la secrezione di insulina sono innescate dopo circa 13 minuti di perifusion, corrispondenti a 6 mM glucosio. Cambiamenti nelle potenzialità mitocondriali sono visto in precedenza come previsto, a circa 11 minuti. Questi dati dimostrano il vantaggio di utilizzare questa rete microfluidica per caratterizzare isolotto fisiologia.

Figura 1. Reazioni fisiologiche alla stimolazione delle cellule insulari.

Discussion

I sistemi tradizionali di perifusion isolotto (macroscala e microscala) hanno alcune limitazioni tra cui complesso di configurazione e design, elevate esigenze tecniche, e la difficoltà di creare utenti prescritto gradienti chimici nel sistema. Il sistema perifusion microfluidica descritto qui di superare queste limitazioni con geometria semplice di progettazione e fabbricazione. Più importante, questo sistema può essere integrato con l'approccio di imaging a fluorescenza che forniscono come uno strumento unico per ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siringhe da 60 ml	BD Biosciences
Fura-2 colorante a fluorescenza	Sonde molecolari, Life Technologies
Rhodamine123 Fluorescence	Dye Molecular Probes, Life Technologies
Glucosio	Sigma-Aldrich
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich
30" Tubi in silicone	Cole-Parmer		1/16 x 1/8in
1,5ml Provette Eppendorf	Fisher Scientific
Connettori a Y	Cole-Parmer		1/16” & 4mm
Connettori per siringa	Cole-Parmer		femmina luer plug 1/16”
Connettori diritti	Cole-Parmer		1/16”
Raccordo a gomito	Cole-Parmer		1/16”
Pompa a siringa Havard	Apparecchio
Dispositivo
Piastra riscaldante	PMC
Termometro	Omega Engineering, Inc.
Collettore di frazioni	Gibson
Pippettor	Fisher Scientific
Microscopio a epiflorescenza invertita	Olympus Corporation	IX71
Dispositivo ad accoppiamento di carica	QImaging		Retiga-SRV, Fast 1394