Un protocollo per la produzione di KLRG1 tetramero

Sommario

Questo protocollo descrive la produzione di KLRG1 tetramero, che è un potente strumento per l'analisi di KLRG1 ligandi.

Abstract

Cellule killer lectina come G1 recettore (KLRG1) è un tipo di recettore della glicoproteina transmembrana II inibitorio appartenenti al tipo C-lectina come superfamiglia. KLRG1 esiste sia come monomero e come disolfuro-linked omodimero. Questo ben conservato si trova recettore sulle cellule più mature e recentemente attivato NK e su un sottogruppo di cellule T effettrici / memoria.

Utilizzando KLRG1 tetramero così come altri metodi, E-, N-, e R-caderine sono stati identificati come KLRG1 leganti. Questi Ca ^+-dipendente cellula-cellula molecole di adesione si compone di un dominio extracellulare contenente cinque ripete caderina responsabile interazioni cellula-cellula, un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico che è legato al citoscheletro di actina ^2.

Generazione del tetramero KLRG1 era essenziale per l'identificazione dei KLRG1 ligandi. KLRG1 tetramero è anche uno strumento unico per chiarire la caderina ruoli e giocare KLRG1 nella regolazione della risposta immunitaria e l'integrità dei tessuti.

Protocollo

Preparazione dei corpi inclusi

1. Inoculare 4 x 500 ml di fiaschi TB ciascuno contenente 50 mg / ml di cloramfenicolo carbenicillina e con una cultura durante la notte di batteri che esprime la KLRG1 costruire plasmide. Quando il diametro esterno raggiunge 0,6 A a 600 nm, indurre con l'aggiunta di 0,4 M IPTG e incubare la cultura per ulteriori 4 ore in agitazione a 37 ° C.
2. Risospendere le cellule raccolte in pH tampone risospensione = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 25% (p / v) di saccarosio, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellet possono essere congelati in questa fase.
3. Piscina non più di 60 ml di resuspensions batterica in un bicchiere polipropilene. ....

Discussione

In questo protocollo, viene mostrato come purificare, biotinylate e KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetramero può essere utilizzato per etichettare KLRG1 ligandi mediante citometria di flusso. Sebbene le condizioni ripiegamento dovranno essere testati empiricamente per ogni proteina, altro tipo C lectine potrebbe essere tetramerized utilizzando un protocollo simile. Utilizzando proteine ​​tetramerized come sonde, ligandi di orfano di tipo C recettori lectina potrebbero essere identificati.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Enzima BirA e tampone	Kit di biotinilazione	Avidity	BIRA500
Compresse complete di inibitore di proteasi Mini, senza EDTA	Reagente	Roche Group	11 836 170 001	o equivalente
Cella agitata Amicon	Attrezzatura	EMD Millipore	Modello #8400	o equivalente
Membrana di ultrafiltrazione YM10 NMWL 10K	Materiale per filtrazione	EMD Millipore	13642
Concentratore da 15 ml YM10	Materiale per filtrazione	EMD Millipore	4411
AKTAFPLC	Attrezzatura	GE Healthcare	18-1900-26
Colonna ad alta risoluzione Sephacryl S-200 16/60	Attrezzatura	GE Healthcare	17-1166-01
Streptavidina PE	Reagente	BD Biosciences	554061	o equivalente