Bone Preparazione Undecalcified per Istologia, Istomorfometria e analisi Fluorocromo

Sommario

Istologia ossea Undecalcified fornisce importanti informazioni per una varietà di applicazioni cliniche e di ricerca. E 'tecnicamente impegnativo, soprattutto con esemplari di grandi dimensioni. Questo video illustra il processo di produzione di sezioni di buona qualità e dimostra le difficoltà tecniche e le modalità con le quali per il loro superamento.

Abstract

Istologia ossea Undecalcified dimostra la micro-architettura del tessuto osseo. Esso mostra sia le componenti mineralizzata e cellulare di osso, che fornisce informazioni vitali sul turnover osseo o la formazione dell'osso ed il riassorbimento. Ciò ha enorme importanza in una varietà di applicazioni cliniche e di ricerca. Si produce belle immagini ¹ e consente di tecniche quali la valutazione fluorocromo e istomorfometria ^2. Analisi fluorocromo è una tecnica in cui vengono iniettati coloranti fluorescenti che si legano al calcio in un punto particolare momento, che permette di quantificare la quantità di mineralizzazione in quel dato momento. Istomorfometria è un processo di quantificazione delle ossa a livello microscopico.

Esecuzione di istologia undecalcified osso è tecnicamente impegnativo, soprattutto con esemplari di grandi dimensioni. Si richiede variazioni nella tecnica da quelli utilizzati in paraffina di serie incorporato istologia. Questo video illustra il processo di produzione di sezioni di buona qualità e dimostra le difficoltà tecniche e le modalità con le quali per il loro superamento. Preparazione dei campioni, fissazione e la lavorazione si ottengono con un modo simile a quello di altri tessuti molli, tuttavia a causa della densità e bassa permeabilità di osso molto più tempo di fissazione e tempi di lavorazione sono necessari, spesso prendendo diverse settimane. Incorporare si ottiene utilizzando un mezzo di supporto con durezza simili o uguali e la densità fino all'osso come metacrilato, ma a differenza di infiltrazione di paraffina e l'inclusione, questo è un passo irreversibile. Sezionamento può essere ottenuto dalla macinazione che produce una sezione più spessa, che è ottimale per gli studi, come l'analisi fluorocromo. Questo è meglio realizzato utilizzando una lama di diamante su un macrotome. In alternativa, sezioni più sottili possono essere prodotti per la microscopia ottica e questo si ottiene utilizzando un microtomo slitta con una lama molto affilata. Il microtomo slitta fornisce la solidità e la stabilità necessaria per grandi blocchi duri. Resina sezioni incorporato può essere colorato con una varietà di macchie, di cui sia dimostrato.

Protocollo

1. Il tessuto è inserito in un contenitore sigillato contenente il 10% tampone fosfato soluzione di formalina ^3. Garantire la minima esposizione alla luce, se l'analisi fluorocromo deve essere eseguita, in quanto il fluorocromi sono fotosensibili.
2. Stabilire che l'orientamento del tessuto sarà richiesto.
3. Tagliare il campione a misura, con l'orientamento corretto, utilizzando una sega a nastro. Adottare misure di sicurezza sono rispettate. Il campione viene poi inserito in un contenitore opaco, il cui volume dovrebbe essere circa dieci volte la dimensione del campione per ottenere una fissazione adeguata. Il campione dovrebbe rimanere nella soluzione di formalina per un totale compreso tra una e due settimane a seconda della sua grandezza. E 'suggerito di usare tessuto di controllo per i test e le finalità di ottimizzazione.
4. Controllare il tessuto si inserisce nello stampo embedding e posizionare il tessuto in un contenitore sigillato opaco contenente etanolo al 70%.
5. Processo il tessuto in modo crescente concentrazione di etanolo, schermatura dalla luce e sotto costante agitazione.
   1. Etanolo al 70% 1 settimana
   2. 80% di etanolo 1 settimana
   3. 90% di etanolo 1 settimana
   4. 100% di etanolo 1 settimana
6. Il tessuto viene poi eliminato in butanolo per 1 settimana, ancora una volta schermatura dalla luce e sotto costante agitazione.
7. La densità della resina e le ossa devono essere attentamente abbinati. La densità della resina può essere alterata (vedi punto 8) e si consiglia di incorporare un esemplare primo test per garantire la giusta densità. Noi usiamo Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) per microscopia ottica ed analisi fluorocromo. Se immunoistochimica è richiesta una resina alternativa deve essere usato come Technovit 9100 (Heraeus Kulzer).
8. La soluzione 7100 Technovit preparazione può essere miscelata con piccole aliquote della soluzione rammollimento fornito con il kit, se richiesto, ma a non più del 5% il volume di soluzione preparazione, nella nostra esperienza la soluzione di ammorbidimento è raramente necessaria. Parti uguali di etanolo assoluto e liquidi Technovit di base 7100 sono mescolati e applicati al tessuto come una pre-infiltrazione soluzione per 24 ore, riducendo al minimo l'esposizione alla luce e con agitazione.
9. La soluzione di infiltrazione è poi costituita con 1 g di induritore I (= 1 borsa), che si scioglie in 100 ml di liquido base. Questo sostituisce il pre-infiltrazione soluzione ed è autorizzato a infiltrarsi per 1 settimana in agitazione costante.
10. Posizionare il tessuto nello stampo, con la faccia superficie di taglio verso il basso. Assicurarsi che vi sia un margine (idealmente almeno 5 millimetri) di tutto il tessuto per la resina, che assicura robustezza blocco. Mescolare 15ml di soluzione di preparazione Technovit 7100 con 1 ml di indurente II e versare attorno campione nello stampo e coprire di almeno 5 millimietres. Curare avrà inizio entro 2 ore, ma sarà completo durante la notte.
11. Montaggio viene quindi eseguita da modellare un blocco di supporto utilizzando Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mix Technovit 3040 con un rapporto volume di 2 parti di polvere e 1 parte di liquido per ottenere un liquido viscoso. Versare Technovit 3040 nella rientranza sul retro del blocco ad un livello di almeno 2 mm al di sopra della base del blocco. Dopo circa 10 minuti lo stampo può essere staccato e il blocco è pronto.
12. La densità e quindi la proprietà di taglio della resina in metacrilato sono suscettibili di l'umidità nella stanza. I blocchi devono essere conservati in un essiccatore.
13. Sezionamento terra produce grandi sezioni tra 20-50 micron di spessore. E 'utile per l'analisi fluorocromo (vedere la sezione sotto), come più spesso sezioni produrre più luminoso fluorescenza. Fissare il disco diamantato per macrotome. Aggiungere lubrificante, come lo spirito di petrolio al serbatoio sul macrotome. Fissare il blocco nel morsetto e orientare a lama. Lasciare rettifica avvenga lentamente (circa 20-30 minuti per ogni sezione) garantire un'adeguata lubrificazione. La prima sezione espone il volto di taglio e orienta la sezione, deve essere eliminato.
14. La sezione successiva è poi inserito in una diapositiva Superfrost Plus. La sezione ha la tendenza ad arricciarsi quindi si consiglia di mettere una parte di un sacchetto di panini su di esso e poi tenendola piatta con un altro scivolo bloccato in posizione. E 'poi inserito in un incubatore di tra 60-80 gradi centigradi per 1 ora. Questo ammorbidisce la metacrilato e aiuta la sezione aderire alla diapositiva in modo piatto.
15. La sezione a terra può essere pulito e lucidato, come richiesto con carta vetrata fine grana in modo gentile.
16. Il microtomo slitta tagli sezioni sottili, che fornisce le migliori sezioni per microsocopy luce. Utilizzare un microtomo slitta come ha aggiunto la rigidità, che è richiesto per il taglio di questi blocchi duri. In alternativa, un microtomo rotativo alimentato può essere utilizzato. Utilizzare una lama affilata in acciaio inossidabile. E 'preferibile avere a disposizione due lame come si può essere affilati come l'altro viene utilizzato. La lama deve fare un angolo di 45 gradi con il blocco. Suammorbidimento rface può essere ottenuto applicando una carta bagnata al blocco, se necessario. Si può richiedere diverse sezioni per realizzare le condizioni di taglio desiderata per ottenere una sezione di qualità. La sezione è poi quotata in un bagno di acqua e posto su un vetrino come in 16 di cui sopra.
17. Reagenti di colorazione sono elencati in Materiali di seguito. Protocolli si basano su ⁴ Bancroft et al. A causa della variazione di spessore si consiglia di ottimizzare le macchie sui vetrini. Rack può causare colorazione dei tessuti a galleggiare fuori dalla diapositiva in modo da aggiungere le macchie direttamente a una diapositiva piatto può essere richiesta. Un protocollo identico o colorazione rack è necessario per esiti colorazione costante necessaria per istomorfometria.
    1. Ematossilina ed eosina
       1. Macchia con Haematoxyilin 5-10 minuti
       2. Lavare bene con acqua di rubinetto Scott s
       3. Colorare con Eosina 5 minuti
       4. Lavare in acqua di rubinetto
       5. Chiara in xilene
       6. Montare
       7. Risultati
          1. Osteoide = rosa
          2. Osso calcificato = bruno violaceo
          3. Nuclei = blu
    2. Von Kossa
       1. Posto in soluzione di nitrato d'argento e di esporre alla luce forte fino a quando l'osso mineralizzato diventa nero (circa 10 minuti)
       2. Lavare in acqua distillata per tre volte
       3. Minaccia con tiosolfato di sodio per 5 minuti
       4. Lavare in acqua distillata
       5. Contrasto con Safrinin O
       6. Chiara in xilene
       7. Montare
       8. Risultati
          1. Osso mineralizzate = nero
          2. Osteoide = rosso / rosa
    3. Masson tricromica Goldner s
       1. Lavare con alcool alcalino (90mls del 80% etanolo e 10mls del 25% di ammoniaca per 20 minuti)
       2. Risciacquare con acqua
       3. Sciacquare con acqua distillata
       4. Colorare con Ematossilina Weigert s per 10 minuti
       5. Sciacquare con acqua distillata
       6. Macchia con Ponceau-fucsina soluzione finale 5 minuti
       7. Sciacquare con 1% di acido acetico 15 secondi
       8. Colorare con fosfomolibdico acido-arancio soluzione G 5 minuti
       9. Sciacquare con 1% di acido acetico 15 secondi
       10. Macchia con la luce verde 5 minuti
       11. Sciacquare con 1% di acido acetico 3 cambi
       12. Sciacquare con acqua distillata
       13. Montare
       14. Risultati
           1. Osso mineralizzate = verde
           2. Osteoide = rosso / arancio
           3. Nuclei = blu grigio
           4. Cartilagine = viola
18. Preparazioni fluorocromo:
19. Questi sono somministrati mediante iniezione endovenosa lenta, di almeno due settimane di distanza.
20. Dosi
    1. Calceina verde 10 mg / kg IV
    2. Ossitetraciclina 50 mg / kg IV
    3. Alizarina complessone 30 mg / kg IV
21. Preparazione di calceina verde
    1. Un grammo di calceina verde è titolato con NaOH 1 M fino alla dissoluzione.
    2. pH è regolato con l'1% NaOH fino a pH = 7,1-7,2.
    3. Filtrare e tenere al riparo dalla luce
22. Preparazione di alizarina complessone
    1. Tre grammi di alizarina complessone è titolato con NaOH 1 M fino alla dissoluzione.
    2. pH è quindi regolata con 1% di HCl o NaOH fino a pH = 7,1-7,2.
    3. Filtrare e tenere al riparo dalla luce
23. Preparazione del Ossitetraciclina
    1. Ossitetraciclina è disponibile come al largo della piattaforma anti-microbico della droga. Non è necessaria la preparazione.

Materiali

a) Hemotoxylin soluzione
Hemotoxylin	1g
Alcol assoluto	100 ml
b) Soluzione di ferro
30% acquosa di cloruro ferrico	4 ml
Acido cloridrico (concentrato)	1 ml
Acqua distillata	95mL

a) Ponceau de xilidina soluzione
Ponceau de xilidina	0,75 g
acido fuchsion	0,25 g
Acido acetico	1 ml
mescolare e aggiungere acqua distillata (100ml)
b) azophloxin soluzione
Azophloxin	0,5 g
L'acido acetico	0,6 ml
mescolare e aggiungere acqua distillata (100ml)
c) Finale di lavoro soluzione macchia
Ponceau-fucsina soluzione	5-10ml
Azophloxin	2 ml
0,2% soluzione di acido acetico	88mL

Luce verde	1g
acido acetico	1 ml
Mescolare e aggiungere acqua distillata (500ml)

Fosfomolibdico acido	3g
Arancio G	2g
Sciogliere in 500 ml di acqua distillata e aggiungere timolo cristallo.

1% di nitrato d'argento acquoso

Tiosolfato di sodio 2,5%

1% safranina O

Alcian blu 8GX	1g
3% di soluzione di acido acetico	100 ml

a) Harris hemotoxylin
Hemotoxylin	2.5g
Alcol assoluto	25mL
Allume di potassio	50g
acqua distillata	500mL
ossido di mercurio	1.25g O
Iodato di sodio	0,5 g
Acido acetico glaciale	20 mL
b) Eosina soluzione
Eosina prodotto commercialmente è stato utilizzato.

Fabbricante	Fluorocromo	Numero di catalogo
Sigma-Aldrich, Sydney	Calceina verde	C0875
Sigma-Aldrich, Sydney	Alizarina complessone	A3882
Intervet Australia, Victoria	Ossitetraciclina (Fuori della droga scaffale antimicrobici)	Nome commerciale; Engemycin 100