Questo video dimostra come ottenere ematociti concentrati (cellule del sangue) dal hawaiano bobtail calamari, Euprymna scolopes Per l'utilizzo in saggi di adesione cellulare biologico e batteriche. Ematociti concentrati sarà tinto con un colorante fluorescente ed esposto a GFP-etichettata batteri.
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Articolo metodologico
Ottenere ematociti concentrati dal hawaiano Bobtail Squid Euprymna scolopes L'osservazione e la loro aderenza ai batteri simbionti e non Symbiotic
In questo articolo
Sommario
Abstract
Studi riguardanti il ruolo del sistema immunitario nella mediazione di segnale molecolare tra batteri benefici ei loro ospiti hanno, negli ultimi anni, dato un contributo significativo alla nostra comprensione della co-evoluzione degli eucarioti, con la loro flora batterica. L'associazione simbiotica tra l'hawaiano bobtail calamari,
Protocollo
- Preparare 500 ml di 0,22 micron, sterilizzata per filtrazione di acqua di mare artificiale (FSW; salinità 35 ppt). Filtro acqua di mare artificiale o naturale attraverso un micron 0,22 micron filtro per rimuovere le particelle e batteri.
- Anestetizzare un adulto hawaiano bobtail calamari (Euprymna scolopes), mettendo in una soluzione al 2% di etanolo in FSW. Posto l'animale in anestesia per circa 10 minuti. Il calamaro cesserà di nuoto e non rispondere attivamente al tatto. Respirazione continua, indicato dal movimento del mantello, e l'attività chromatophore dovrebbe essere ancora osservato.
- Luogo calamari con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un vassoio standard dissezione cera. Immergere l'animale con FSW contenente 2% di etanolo.
- Utilizzando uno standard da 200 puntali microlitri, tirare indietro l'imbuto e il mantello di esporre il vaso sanguigno principale cefalica si trova tra i due occhi.
- Usando una siringa sterile 1 ml con ago calibro 26,5, forare il vaso sanguigno cefalica e ritirare tra 50-100 ml di emolinfa. Posizionare il emolinfa in un tubo sterile 1,5 ml su ghiaccio.
Nota: Se un animale servirà come donatore più volte, solo prelevare 10-20 ml di emolinfa in un dato momento. Rispedire l'animale verso un serbatoio di acqua di mare normale. L'animale farà rivivere in 30 minuti. - Ematociti concentrati appena raccolte vengono lavate e risospese in 500 ml di soluzione Ringer Squid s (S-Inseparabili, 530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl 2, 10 mM CaCl 2 e 10 mM tampone HEPES, pH 7,5).
- Le concentrazioni Hemocyte sono determinati da emocitometro, e circa 2.000 cellule sono aggiunti chambered scivola copertura in vetro, e ha permesso di aderire al vetro per 10 minuti a temperatura ambiente. A questa densità, il ematociti concentrati formano un monostrato uniforme sulla superficie del vetrino.
- Per osservare batterica legame ematociti concentrati host, ematociti concentrati sono esposti ad un ceppo batterico fluorescente come il Vibrio fischeri ES114 e / o Vibrio harveyi B392, ognuno contenente un reporter verde fluorescente. V. fischeri ES114 e V. harveyi B392 sono cresciuto fino a metà-log in una fase di acqua di mare triptone media (SWT) a 28 ° C in un agitatore orbitale. La densità ottica a 600 nm viene misurata spettrofotometricamente a determinare la densità delle cellule. I batteri sono pellet per centrifugazione (5.000 rpm per 5 min), il supernatante viene scartato e il pellet è risospeso in S-Ringers.
- 100.000 cellule batteriche vengono aggiunti a ciascuna camera bene in modo che ci sono 50 batteri per hemocyte in media. Il hemocyte / miscele di batteri vengono incubati in soluzione Ringer S-s a 25 ° C per 1 h, un tempo determinato per produrre il massimo livello di legame.
- Citoplasma della ematociti concentrati vengono poi colorate con CellTracker fluorescente arancione 0,005% (Invitrogen) e poi lavati in S-Ringers per visualizzare le cellule.
- Ematociti concentrati colorati con i batteri associati sono visualizzati da fluorescenza utilizzando un Zeiss Discovery stereoscopio fluorescenti V20 SP2 o un microscopio laser confocale Leica spettrale, ed enumerate su tutta la superficie della cellula animale.
Rappresentante Risultati
Perché emolinfa cefalopodi contiene hemocyanin extracellulare e non emoglobina, dopo l'ossigenazione, la emolinfa diventa blu scuro. Una media di ~ 5000 ematociti concentrati per l di emolinfa si ottiene con questo metodo. Dopo l'adesione al scivola coprire i camerati e colorazione fluorescente, il ematociti concentrati dovrebbe apparire luminoso fluorescente rosso e ameboidi in forma. Per adesione batterica, V. fischeri aderisce male al ematociti concentrati (1-2 cellule batteriche per cellula del sangue), mentre V. harveyi aderisce fortemente (10-15 cellule batteriche per hemocyte).
Figura 1. Adulto Hawaiano bobtail calamari Euprymna scolopes mostra la posizione dei vasi sanguigni cefalica.
Figura 2. Risultati di esposizione hemocyte di Vibrio fischeri (A) e Vibrio harveyi (B). Rosso, Cell Tracker Arancione, verde, GFP-etichettata batteri.
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Discussione
Studi riguardanti il ruolo del sistema immunitario nella mediazione di segnale molecolare tra batteri benefici ei loro ospiti hanno, negli ultimi anni, dato un contributo significativo alla nostra comprensione della co-evoluzione degli eucarioti, con la loro flora batterica. Il calamaro / vibrione del sistema si è dimostrato come sistema modello trattabile per rispondere alle domande fondamentali in questo campo 2,3,5,6,8. La luce-organo del Euprymna calamari scolopes permette di colonizza...
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Ringraziamenti
Fonti di finanziamento: University of Connecticut Research Foundation e dal Dipartimento di biologia molecolare e cellulare a SVN, Sigma Xi Grant-in-Aid-di Ricerca e Antonio H. e R. Majorie
Romano Graduate Education Fellowship per AJC
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema di camere con coprivetrino in borosilicato #1.0 (8 camere) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| Siringa da 1 ml senza lattice, calibro 26,5 G, per insulina | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| Microscopio SteREO Discovery V20 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Microscopio confocale SP2 | Leica Microsystems |
Riferimenti
- Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis. Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).
- McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes. Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri. Biol Bull. 195, 89-97 (1998).
- Visick, K. L., Ruby, E. G. Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).
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Ristampe e permessi
