L'impianto di Ferumoxides etichetta cellule staminali mesenchimali in difetti della cartilagine

Sommario

Obiettivo della presentazione è quello di dimostrare un metodo altamente riproducibile per generare matrice associata impianti di cellule staminali a difetti della cartilagine, che può essere visualizzato con la RM. Le cellule staminali sono etichettati con FDA ha approvato Ferumoxides, mescolato con agarosio, impiantati in difetti della cartilagine e ripreso con uno scanner 7T MR.

Abstract

Il campo della ingegneria dei tessuti integra i principi della biologia cellulare ingegneria e medicina verso la rigenerazione di cellule specifiche e tessuti funzionali. Matrice associata impianti di cellule staminali (MASI) mirano a rigenerare i difetti della cartilagine a causa di lesioni alle articolazioni artritiche o traumatica. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) hanno la capacità di differenziarsi in cellule della linea condrogenico e hanno mostrato risultati promettenti per cellulari basati su tecnologie di riparazione della cartilagine articolare. Autologo di cellule staminali mesenchimali possono essere isolate da una varietà di tessuti, può essere ampliato in colture cellulari, senza perdere il loro potenziale di differenziazione, e hanno dimostrato condrogenico differenziazione in vitro e in vivo ^{1, 2.}

Al fine di garantire la conservazione locale e la vitalità delle cellule staminali mesenchimali trapiantate in difetti della cartilagine, un ponteggio è necessario, che supporta anche la differenziazione e la proliferazione successive. L'architettura del tessuto patibolo formazione di guide e permette la matrice extracellulare, prodotto dalle cellule staminali, ad espandersi. Indagini precedenti hanno mostrato che un 2% di agarosio impalcatura può sostenere lo sviluppo della cartilagine ialina stabile e non induce risposte immunitarie ^3.

Conservazione a lungo termine delle cellule staminali trapiantate nel MASI è fondamentale per la rigenerazione della cartilagine. L'etichettatura di MSC con nanoparticelle di ossido di ferro permette di lungo termine il monitoraggio in vivo con non invasive tecniche di imaging RM ^4.

Questa presentazione dimostrerà le tecniche per MSC etichettatura con nanoparticelle di ossido di ferro, la generazione di cellule-agarosio costrutti e l'impianto di questi costrutti nei difetti della cartilagine. I costrutti etichettati possono essere monitorati in modo non invasivo con MR-imaging.

Protocollo

1. L'etichettatura di hMSCs con Endorem

1. Le cellule sono coltivate a 80% confluenza di almeno 18 ore prima di etichettatura.
2. Durante questo periodo, i media di etichettatura si prepara aggiungendo Endorem al campione ad una dose di 100 ug Fe / ml di siero-media liberi.
3. Dopo che le cellule sono coltivate a confluenza, la cultura media è aspirato e le cellule vengono lavate con PBS 1x o senza siero dei media.
4. Quindi, la soluzione di risciacquo viene aspirato e dei media etichettatura precedentemente preparato viene aggiunto. Le cellule vengono poi incubate a 37 ° C, 5% di CO ₂ per 4 ore.
5. Dopo 4 ore di incubazione, l'etichettatura dei media è aspirato e le cellule vengono sciacquati con PBS e trypsinized come al solito.
6. Una volta trypsinized, le cellule vengono lavate 3 volte con PBS e centrifugati a 400rcf per 5 minuti.
7. Dopo questa fase di lavaggio, le cellule sono risospese, contati, valutati per la viabilità, e utilizzato come necessario per la sperimentazione.

2. Preparazione agarosio

1. Dopo che le cellule sono state etichettate è tempo di preparare la soluzione agarosio.
2. Su una scala bene, 80 mg di polvere di agarosio sono pesati e aggiunti 2 ml di PBS.
3. Questa soluzione è poi delicatamente scossa e sterilizzati in autoclave.
4. Dopo circa 40 minuti, la soluzione di agarosio fluido può essere tolto dal autoclave. Il volume deve essere misurato e regolato di conseguenza, preriscaldato PBS.
5. Allora la soluzione è raffreddata a 42 ° C

3. Creazione MASI

1. Quando la soluzione di agarosio ha raggiunto la temperatura desiderata, le celle sono contati e centrifugati per l'ultima volta in un tubo Eppendorf 1,5 ml.
2. Dopo la centrifugazione, il surnatante viene eliminato e le cellule sono mescolate con le DMEM di raggiungere una concentrazione di 30 x 10 ⁶ cellule / ml.
3. Ora, le cellule sono mescolate con i 42 ° C caldo agarosio.
4. Un puntale freddo può causare agarosio a solidificare all'interno della punta, quindi si consiglia di preriscaldare la punta pipettando caldo PBS sterile su e giù
5. Ora, lo stesso volume di agarosio come media è ripreso e miscelare con la cellula-media-sospensione in modo che una sospensione omogenea viene creato.
6. Tenere il tubo Eppendorf all'interno di un bagno d'acqua preriscaldata mescolando in modo che l'agarosio non si raffredda abbastanza per solidificare.
7. Quando la sospensione è omogenea, le cellule vengono impiantate nel difetto.

Figura 1. Coronale T2 pesate SE (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) di un campione rotula con hMSCs impiantati in difetti della cartilagine.

Discussione

Il protocollo descritto fornisce un modo riproducibile per etichettare MSC con nanoparticelle di ossido di ferro e di impianto tali etichettati MSCs in difetti della cartilagine. Questa tecnica permette non invasiva rappresentazione dei trapianti di cellule staminali a difetti della cartilagine con la RM, che consente una diagnosi precoce di fallimento MASI. Una lussazione o efflusso delle cellule etichettate può essere diagnosticata sulla base di una scomparsa del marchio dal sito trapianto sulle immagini MR. Una diagn...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
D-MEM ad alto contenuto di glucosio	Reagente	Sigma-Aldrich	D5648
PBS (senza Ca++, Mg++)		GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Tripsina-EDTA 0,05%		Invitrogen	25399-120
FBS		Hyclone	SH30071.03
Penicillina/Streptomicina		GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Ferumoxidi (Endorem)		Guerbet
Agarosio tipo VII		Sigma-Aldrich	A9045	Sciogliere l'agarosio in PBS fino a una concentrazione finale del 4%