Mama è un unico Magnetosome proteina associata che ha dimostrato di essere coinvolti nella attivazione magnetosome. Qui vi presentiamo il protocollo di purificazione di Mama cancellazione mutante (MamAΔ41) da M. magneticum AMB-1.
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Articolo metodologico
Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41
In questo articolo
Sommario
Abstract
Batteri magnetotactic comprendono un gruppo eterogeneo di microrganismi acquatici che sono in grado di orientarsi lungo i campi geomagnetici. Questo comportamento è creduto per aiutare la loro ricerca di ambienti adatti
Protocollo
1. Clonazione ed espressione di Mama Gene in E. coli
Il gene mutante mamAΔ41 è stato amplificato utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) dal DNA genomico di Magnetospirillum magneticum AMB-1, con primer: 5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 'e 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'. Nei frammenti di DNA amplificato, un sito che NcoI è stato introdotto al codone di inizio ATG e il codone di terminazione è stata sostituita con un sito ScoI. I frammenti sono stati digeriti con NcoI e Saci e clonato nei rispettivi siti di pET52b (+), dando luogo a pET52bMamAΔ41-AMB1. In questo costrutto, il gene è st....
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Discussione
Purificazione di proteine è il passo principale in qualsiasi biochimica delle proteine o studi strutturali. Dato che ogni proteina è unico, con il proprio comportamento, si ha la necessità di definire le sue proprietà e modificare di conseguenza la sua purificazione. Obiettivo di proteine deve essere analizzato come un primo passo verso la purificazione mediante strumenti bioinformatici. Sono utilizzati per calcolare la iso-elettrico punto di destinazione, valutare la sua necessità di ridurre / ossidanti dell'.......
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Ringraziamenti
Noi riconosciamo il dottor Amir Aharoni per il suo sostegno e Gheula Davidov, Noam Grimberg e Chen Guttman per i loro consigli e commenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Attrezzatura | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-078A | |
| Cella a pressione | Attrezzatura | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 | |
| Ultracentrifuga | Attrezzatura | Sorvall, Thermo Scientific | Discovery 90SE | |
| Rotore | Attrezzatura | Beckman Coulter Inc. | Ti60 | |
| Provette per ultracentrifuga; provette con tappo da 26,3 ml | Attrezzatura | Beckman Coulter Inc. | BC-355618 | |
| Colonne cromatografiche in vetro da 2,5 cm di diametro, Econo-Column | Attrezzatura | Bio-Rad | 737-2521 | |
| Resina Ni-NTA His Bind | Attrezzatura | Novagen, EMD Millipore | M0063428 | |
| Spettrofotometro | Attrezzatura | Amersham | Ultraspec 2100 pro | |
| Cuvette in quarzo | Attrezzatura | Hellma | 104-QS | |
| Cromatografia liquida ad alte prestazioni – AKTA purifier 10 | Attrezzatura | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| Colonna a scambio ionico – MonoQ 4,6/100 PE | Attrezzatura | GE Healthcare | 10025543 | |
| Colonna pre-impacchettata per esclusione dimensionale – HiLoad 26/60 Superdex 200 | Attrezzatura | GE Healthcare | 17-1071-01 | |
| Centricon – Vivaspin15 – 10.000 MWCO | Attrezzatura | Sartorius AG | VS1501 | |
| Centrifuga da banco | Attrezzatura | Thermo Fisher Scientific, Inc. | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Attrezzatura | Bruker Corporation | Reflex IV | |
| Tris-HCl (idrossimetil) aminometano | Reagente | BioLab | 20092391 | |
| Cloruro di sodio | Reagente | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazolo | Reagente | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| Cocktail di inibitori delle proteasi senza EDTA | Reagente | Sigma-Aldrich | P-8849 | |
| Dnase I (Deossiribonucleasi I) | Reagente | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Trombina bovina | Reagente | Fisher Scientific | BP25432 | |
| Glicina | Reagente | BioLab | 07132391 | |
| Sodio dodecilsolfato (SDS) | Reagente | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercapto–etanolo | Reagente | Sigma-Aldrich | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagente | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagente | Fermentas | SM0671 |
Riferimenti
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).
- D'Andrea, L. D., Regan, L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).
- Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F,
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Ristampe e permessi
