Recupero degli ovociti mouse

Sommario

Questo protocollo illustra la tecnica per l'estrazione di ovociti o di embrioni fecondati in fase iniziale dalla ovidotto di topi. La capacità di identificare i infindibulum e inserire un ago senza punta fine in esso è essenziale per eseguire correttamente la procedura.

Abstract

Fino ad oggi, solo pochi studi hanno riportato manipolazioni successo dell'embriogenesi Peromyscus o biologia riproduttiva. Insieme con la Borsa di Centro Genetico Peromyscus (http://stkctr.biol.sc.edu), si stanno caratterizzando le differenze salienti necessari per sviluppare questo sistema. Un obiettivo primario è stato quello di ottimizzare ovociti / recupero embrione precoce.

Protocollo

Embrione / recupero degli ovociti

1. Almeno due ore prima il recupero degli embrioni / ovociti, KSOM si trova nel 37 º C CO ₂ incubatore e FHM devono essere scongelati da -20 °. Un piatto di vetro contenente tre pozzi poco profondi concava viene usato per gocce casa di KSOM nell'incubatrice. Per prevenire la disidratazione, la KSOM piatto e sono posti in un contenitore con coperchio che ha l'acqua sul fondo. Questo apparecchio evita l'evaporazione senza l'uso di olio minerale.
   
   
2. Gli ovidotti da una femmina l'ovulazione sono posti nei media FHM. Per garantire l'orientamento e un infindibulum intatto, una piccola sezione delle ovaie viene tagliato con la sezione ovidotto e piccoli dell'utero. Un brusco 30 gauge viene utilizzato per espellere gli embrioni / ovociti dalla ovidotto inserendo l'ago smussato nel infindibulum. Il infindibulum deve essere utilizzato per recuperare gli embrioni in quanto il tubo ovidotto è troppo piccolo per un ago per passare. Nel caso in cui il infindibulum è distrutto, l'ovidotto deve essere affettato aperto o embrioni spremuto.
   
   
3. Gli embrioni / ovociti si trovano nei media FHM puntando al microscopio sulla goccioline di grasso che hanno toccato il fondo della scatola di Petri. Embrione / ovocita isolamento può essere ottenuto a 20x come questa fornisce un'area di visualizzazione più grande di ingrandimento. Embrione / ovociti sembrano rotonda goccioline di grasso che hanno un anello chiaro intorno ad esso. Pipette a bocca, utilizzando un bicchiere tirato capillare, viene utilizzato per spostare gli embrioni / ovociti per KSOM per l'incubazione e di ulteriori manipolazioni.

Procedura per il recupero degli ovociti

Preparazione

1. Scongelare FHM e preparare kSOM.
2. Poche ore prima, kSOM porlo in un contenitore prelievo degli ovociti e il luogo in scatola punta con acqua sul fondo, luogo di CO ₂ incubatore.
3. Portare gabbie al laboratorio e uccidere le femmine raccolta.
4. Ritagliate le ovidotto facendo attenzione a tagliare alcune delle ovaie e dell'utero alcuni per assicurarsi di non tagliare fuori parte della ovidotto.
5. Posto nei media FHM in piccole piastre di Petri.
6. Versare un paio di mezzi di comunicazione più FHM piastre di Petri da utilizzare per il lavaggio.

Flushing

1. Utilizzare un ago di lavaggio (30 gauge blunt) collegato ad un ago 1 ml con terminale a spirale.
2. Prendete un ovidotto alla volta e con l'ago, inserire infundibolo trova vicino alla parte dell'ovaio sinistro collegato. Se l'infundibolo è distrutto e non può essere usato, poi prendere due pinze e tenere un capo del ovidotto. Con la pinza altri, premere delicatamente, come un tubetto di dentifricio, per espellere ogni dell'embrione.
   
   Nota: Questo creerà una grande quantità di disordine nella scatola di Petri, come un sacco di tessuto verranno con esso, quindi si consiglia di utilizzare un piatto diverso Petri dopo.
   
   
3. Per vedere gli embrioni, messa a fuoco microscopio su pezzi di grasso e cercare rotonda "pezzo di grasso", con chiaro cerchio intorno ad esso.
   
   Nota: Gli embrioni hanno lo stesso aspetto come il grasso, quindi potrebbe essere difficile da trovare. Gli embrioni si depositano sul fondo, in modo da guardare là.
   
   
4. Fare strisci vaginali delle donne destinatario. In questa fase, dovrebbero essere pseudopregnant.

Discussione

In questo articolo, dimostriamo il recupero di ovociti da ovulazione indotta (superovulated) Peromyscus. L'uso di superovulazione (al contrario di naturale ciclo estrale) è comune a causa del numero molto maggiore che ne derivano. Tuttavia, bisogna fare attenzione nell'interpretare tali risultati utilizzando ovociti / embrioni, in quanto entrambi gli ormoni usati per indurre l'ovulazione e la coltura può avere effetti.

Quando estrale è stata confermata, le femmine sono euthenized e ovidotti recuperato insieme ad una picc...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ago per lavaggio	Strumento	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G ottuso
Pinzette (2)	Strumento	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animale	Peromyscus Genetic Stock Center
Forbici	Strumento	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Mezzo FHM tamponato con HEPES	Reagente	Specialty Media	MR-025-d
Mezzo di coltura embrionale KSOM (5x 10 mL)	Reagente	Specialty Media	MR-020P-5F
Pipetta orale	Strumento			Tirata da capillari di vetro e collegata a tubo di gomma
Piatto per il mantenimento degli ovociti	Strumento			Contenitore di vetro con depressioni concave