Ottimizzato fibrina Gel Bead Assay per lo studio della angiogenesi

Sommario

Questo video dimostra il protocollo di un test in vitro angiogenesi che ricapitola diverse fasi di angiogenesi. Time-lapse immagini di germinazione, formazione lumen, ramificazione e anastomosi - caratteristiche fondamentali di angiogenesi - sono mostrati.

Abstract

L'angiogenesi è un complesso processo multi-step, dove, in risposta a stimoli angiogenici, vengono creati nuovi vasi da vasi esistenti. Questi passaggi sono: la degradazione della membrana basale, la proliferazione e la migrazione (germogliamento) delle cellule endoteliali (CE) nella matrice extracellulare, l'allineamento della CE in corde, rami, la formazione di lume, anastomosi, e la formazione di una nuova membrana basale. Molti test in vitro sono stati sviluppati per studiare questo processo, ma la maggior parte solo mimare alcune fasi dell'angiogenesi, e morfologicamente i vasi all'interno del test spesso non assomigliano vasi in vivo. Sulla base di un precedente lavoro di Nehls e Drenckhahn, abbiamo ottimizzato un test in vitro che utilizza angiogenesi umano vena ombelicale CE e fibroblasti. Questo modello racchiude in sintesi tutte le fasi fondamentali all'inizio di angiogenesi e, soprattutto, i vasi di visualizzazione brevetto lumen intercellulare circondato da polarizzata CE. CE sono rivestiti su microcarriers cytodex e incorporato in un gel di fibrina. I fibroblasti sono stratificate sulla parte superiore del gel in cui prevedono necessario fattori solubili che favoriscono CE spuntano dalla superficie delle perline. Dopo alcuni giorni, sono presenti numerosi vasi che possono essere facilmente osservati in contrasto di fase e microscopia time-lapse. Questo video illustra i passaggi chiave nella creazione di queste culture.

Protocollo

CELLE DI PREPARAZIONE

1. Portare HUVEC e fibroblasti in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 giorni prima della bordatura.
2. Passa medio EGM-2 (Clonetics) il giorno prima per bordare HUVEC e il giorno prima di embedding per fibroblasti.
3. Una concentrazione di ~ 400 HUVEC al tallone è necessario.
4. 20.000 fibroblasti per pozzetto è necessario.

RIVESTIMENTO CON LE PERLE HUVEC - GIORNO -1

1. Trypsinize HUVEC.
2. Lasciare perle di stabilirsi (NON CENTRIFUGA!). Aspirare il surnatante e lavare le perline brevemente in 1 ml di caldo EGM-2 di media.
3. 2500 perline mix w / 1x10 ⁶ HUVEC in 1,5 mL di caldo EGM-2 di media in un tubo di FACS. Posto verticalmente all'interno dell'incubatore. (Questo sarà sufficiente per circa 10 pozzi. Scala fino, se necessario)
4. Incubare per 4 ore a 37 ° C, agitando la provetta ogni 20 min. (Rivestimento Buona è fondamentale per la germinazione.)
5. Dopo 4 ore, trasferire le perle rivestite per un pallone T25 in 5 ml di EGM-2 e lasciare O / N.

INCASSO PERLE RIVESTITO IN FIBRINA GEL - GIORNO 0

1. Preparare il mg / ml soluzione di fibrinogeno 2,0 (vedi sezione ricette).
2. Aggiungi 0,15 Unità / ml di aprotinina alla soluzione fibrinogeno.
3. Trasferimento perle rivestite per un tubo 15 ml conica e lasciate perline stabilirsi. Perline risospendere in 1 ml di EGM-2 e trasferimento in un tubo da centrifuga 1,5 ml.
4. Lavare le perle 3 volte con 1 ml di EGM-2 da pipeting su e giù lentamente.
5. Contare perle su un vetrino e risospendere in soluzione fibrinogeno ad una concentrazione di circa 500 perline / mL.
6. Aggiungi 0,625 Unità / ml di trombina in ciascun pozzetto.
7. Aggiungere 0,5 ml di sospensione fibrinogeno / perla a ciascun pozzetto di una 24-pozzetti.
   
   Cambia la punta della pipetta per ogni bene!
   
   
8. Mescolare la trombina e il fibrinogeno andando su e giù delicatamente con la punta della pipetta ~ 4 a 5 volte. Fare attenzione a non fare bolle di grandi dimensioni.
9. Lascia la piastra per 5 minuti nel cofano, poi metterlo nel 37 ° C-incubatore per 10-15 minuti per generare un coagulo.
10. In attesa del coagulo, trypsinize fibroblasti.
11. Aggiungere 1 ml di EGM-2 per pozzetto goccia a goccia.
12. Fibroblasti seme sulla cima di fibrina gel ad una concentrazione di 20.000 cellule per pozzetto.

NOTE:

Di solito, quando il gel di fibrina si forma, si vedrà bollicine nel gel. Non preoccupatevi, spariranno in 3-4 giorni.

Cambiare il supporto a giorni alterni, cioè, Giorno 2, 4, 6, ecc ..

Di giorno 3 o 4 si dovrebbe iniziare a vedere germogliare.

Discussione

C'è un consenso crescente che tridimensionali (3D) saggi in vitro angiogenesi offrire un modello che è molto più vicino all'ambiente reale in vivo che può essere raggiunto utilizzando culture 2D. È evidente che sistemi 3D superiore dovrebbe essere riproducibile, ed essere in grado di mimare alcuni dei passaggi principali di angiogenesi. Mentre diversi saggi precedenti 3D sono stati sviluppati, molti di questi utilizzare difficili da ottenere cellule microvascolari, o solo ricapitolare alcune delle tappe. In questo video, si descrive...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Perle Cytodex-3	Reagente	Amersham	17-0485-01	10 g/flacone. Idratare e gonfiare da 1,0 a 5 g di perle secche in 50 mL di PBS (pH = 7,4) per almeno 3 ore a temperatura ambiente. Utilizzare un tubo da 50 mL e posizionarlo sul rocker. 2. Lasciare sedimentare le perle (~15 min). Rimuovere il soprannatante e lavare le perle per alcuni minuti in PBS fresco (50 mL). 3. Rimuovere il PBS e sostituirlo con PBS fresco: 25 mL -> 20 mg/mL => 60.000 perle/mL oppure 50 mL -> 10 mg/mL => 30.000 perle/mL. 4. Collocare la sospensione di perle in un flacone di vetro silanizzato (Windshield Wiper o Sigmacote). 5. Sterilizzare le perle mediante autoclave per 15 min a 115°C. 6. Conservare a 4°C.
Aprotinina	Reagente	Sigma-Aldrich	A-1153	10 mg/flacone. Ricostruire l'aprotinina liofilizzata a 4 U/mL in acqua deionizzata. Filtrare in condizioni sterili. Preparare aliquote da 1 mL ciascuna. Conservare a -20 °C.
Fibrinogeno Tipo I	Reagente	Sigma-Aldrich	F-8630	1 g. Sciogliere il fibrinogeno in DPBS a una concentrazione di 2 mg/mL. Nota: verificare la percentuale di proteina coagulabile e regolare di conseguenza. Riscaldare in bagnomaria a 37 °C per sciogliere il fibrinogeno. Mescolare capovolgendo il tubo. Non vortexare. Filtrare in condizioni sterili attraverso un filtro da 0,22 µm.
Trombina	Reagente	Sigma-Aldrich	T-3399	22 mg = 1.000 unità. Ricostruire in acqua sterile a 50 U/mL. Preparare aliquote da 0,5 mL ciascuna. Conservare a -20 °C.