Method Article

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

DOI:

10.3791/1863

⸱

March 24th, 2010

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1Department of Biological Sciences and Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

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Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari livelli Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

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Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari livelli

Protocol

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A. coltura cellulare e induzione di proteine

Questa sezione descrive le condizioni di coltura cellulare, ciclo cellulare sincronizzazione con Nocodazole, seguita da induzione di espressione della proteina da un promotore regolabile in cellule di lievito.

  1. Il selvaggio lievito ceppo del tipo W303 (leu2-3, 112 TRP1-1 CAN1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) si trasforma con copia alto (2μ) DNA plasmide che contiene il nostro gene di interesse (ENTH2) sotto il controllo di metionina-reprimibile promotore (MET25). Metionina 2mM è sufficiente per sopprimere l'attività promotore, mentre i media manca metionina permett....

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Discussion

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Questo protocollo descrive come monitorare lo sviluppo di un fenotipo morfologico (cellula di lievito in grado di sottoporsi corretta divisione cellulare) al momento della sovraespressione proteica. Nel fare questa procedura è importante ricordarsi di raccogliere le cellule di lievito da pellettatura alla velocità di centrifugazione raccomandata come velocità più elevate possono danneggiare le cellule ed i risultati oscuri. Blu di metilene e Calcofluor bianco deve essere aggiunto a vivere le cellule appena prima di imag.......

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Acknowledgements

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Ringraziamo Brian G. Coon e Claudia B. Hanna per le discussioni utili e supporto. Questo progetto è stato sostenuto da fondi di start-up dal Dep. di Scienze Biologiche, la Purdue University di Claudio R. Aguilar e un americano Cancer Society istituzionali Research Grant a Claudio R. Aguilar attraverso il Centro Purdue Cancro.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ReagenteNocodazoloSigma-AldrichM1404
Blu di metilene 1% (p/v)ReagenteVWR internazionaleVW6276-0
Calcofluor BiancoReagenteSigma-AldrichF3543
Reagente VaselinaVWR internazionaleVW3339-2

References

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  1. Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
  2. Gietz, R. D., Woods, R. A.

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Protein ConcentrationMorphological PhenotypeBudding YeastWestern BlottingMicroscopy AnalysisTime Lapse VideoSeptin MislocalizationCell Division DefectMethionine Repressible PromoterAgrose Bed Preparation

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