Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin

Sommario

Sospensione colorazione immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per la superficie cellulare marcatori (SSEA-3/SSEA-4) è stato raggiunto sulla base di utilizzo di un self-made apparato cytospin per creare un monostrato di cellule per l'osservazione e la quantificazione.

Abstract

Cellule staminali pluripotenti (hPSCs) che includono cellule staminali embrionali umane (hESC) e umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) sono fonti di cellule eccitante a causa della loro illimitata capacità di auto-rinnovamento e il loro potenziale di differenziarsi in tipi cellulari diversi. Lo stato pluripotente di hPSCs è tipicamente valutata mediante tecniche come qPCR, immunocitochimica, e da altri

Protocollo

Parte 1: Sospensione colorazione immunocitochimica

1. Le cellule sono raccolte in una sospensione di cellule singole.
2. Le cellule sono poi trasferiti in 1,5-microcentrifuga da 2 ml tubi e centrifugati a 200g per 4 minuti.
3. Le cellule sono lavate aspirando fuori surnatante, risospesi in 1 ml di PBS - (senza Mg ^{2 +} e Ca ^{2 +)} e poi centrifugati nuovamente a 200g per 4 minuti. Questo dovrebbe essere fatto due volte.
4. Dopo il lavaggio, le cellule vengono poi fissati dalla ri-sospensione in 1 ml di paraformaldeide 4% (PFA) a temperatura ambiente per 10 minuti.
5. Le cellule sono lavate di nuovo per due volte con 1 ml di PBS -.
6. Dopo il lavaggio, le cellule blocco per ri-sospensione in 1 ml di soluzione di blocco (6% serum/94% PBS -). Incubare questi a temperatura ambiente per 45 minuti.
7. Dopo, centrifugare le provette a 200 g per 4 minuti e aspirare fuori Solution Block. Risospendere le cellule in 1 ml della soluzione di anticorpo primario (fatta con la soluzione al blocco di diluizione consigliato). Le celle possono essere incubate a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 ° C per una notte prima di procedere alla fase successiva.
8. Le cellule vengono poi lavate due volte con 1 ml di soluzione di blocco.
9. Dopo, risospendere le cellule in 1 ml di soluzione di anticorpo secondario (fatta con la soluzione al blocco di diluizione consigliato) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
10. Dopo 1 ora, le cellule devono poi essere lavate di nuovo due volte con 1 ml di soluzione di blocco.
11. Dopo il lavaggio con la soluzione di blocco, lavare le cellule di nuovo con 1 ml di PBS -.
12. Dopo i lavaggi vari, risospendere le cellule in 1 ml di DAPI nucleare macchia (1:10.000 diluizione del DAPI in PBS -) e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
13. Dopo 5 minuti, centrifugare le provette a 200 g per 4 minuti. Aspirare la soluzione nucleare DAPI macchia e risospendere le cellule in 1 ml di PBS -.

Incorporazione di hPSCs nelle diapositive generate attraverso apparato cytospin: parte 2

1. Slitte di plastica vengono preparati facendo la quantità desiderata di fori con un trapano a colonna. Il diametro deve essere al massimo 1 millimetro più grande del diametro massimo della punta micropipetta (s) da utilizzare.
2. Carta da filtro viene tagliata ai parametri del vetrino di plastica con le forbici.
3. I fori vengono poi realizzati in carta da filtro. La dimensione del foro (s) deve essere abbastanza grande che la punta micropipetta (s) si adatta snuggly attraverso di essa.
4. Dopo, una delle diapositive plastica preparato è posizionato sulla parte superiore e una lastra di vetro in posto al fondo della carta filtro taglia (Figura 1). Gli strati sono fissati con nastro adesivo.
5. Un massimo di 100μL (a seconda della densità monostrato desiderato) di sospensione cellulare macchiato da parte 1 viene posto nella parte superiore della punta micropipetta (s).
6. Se necessario, l'apparato con una soluzione di cella può essere pesato e un contro-bilanciamento di peso simile creato.
7. L'apparato cytospin e contro-equilibrio può vengono quindi inseriti in una centrifuga desktop e centrifugato a 200g per 4 minuti.
8. Dopo la centrifugazione, l'apparato cytospin viene accuratamente smontata in un modo che doesnt rimuovere le cellule dal vetrino.
9. Se necessario, l'eccesso di PBS circostanti - dalla parte di vetro in aspirato fuori.
10. Le celle possono poi essere visualizzati con un microscopio a fluorescenza per verificare se il monostrato cellulare desiderato è stato raggiunto.

Parte 3: scivoli di montaggio

1. Una goccia del supporto di montaggio desiderata viene inserito direttamente nel centro di ogni area contenente le cellule.
2. Dopo, una scivolata coperchio è abbassato delicatamente sul diapositive cercando di evitare bolle d'aria, se possibile.
3. Eccesso di mezzi di montaggio viene quindi rimosso da diapositive.
4. Dopo, i lati del coprioggetto sono sigillati con smalto.
5. Le slide possono essere conservati in un deposito scuro finché i risultati sono stati osservati e documentati.

Discussione

Ai fini del nostro laboratorio, un piatto di 35 mm di colture di cellule staminali coltivate su fibroblasti embrionali del mouse (MEF) è assegnato per la procedura di colorazione immunocitochimica per l'utilizzo con l'apparecchio cytospin. Le cellule sono poi raccolti tramite enzimatica passaging, eliminando quanto più dello strato MEF possibile, in una cella singola sospensione. Se è più efficace isolamento delle cellule staminali dallo strato MEF si desidera, le colonie possono essere raccolte manualmente poi ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Materiale per vetrini di plastica riutilizzati
Vetrini Microscopici Superfrost/Plus Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Punte Filtranti 0.1-10μL	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Vetrocopri Microscopico	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Mezzo di montaggio
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Serum di capra normale	Invitrogen	10000C
Anticorpo monoclonale Anti-SSEA-4 di topo	EMD Millipore	MAB4304	Anticorpo primario per la colorazione SSEA-4
Anticorpo monoclonale Anti-SSEA-3 di ratto	EMD Millipore	MAB4303	Anticorpo primario per la colorazione SSEA-3
Alexa Fluor 488 IgG di capra anti-topo	Invitrogen	A11029	Anticorpo secondario per la colorazione SSEA-4
IgG di capra anti-ratto marcato con Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Anticorpo secondario per la colorazione SSEA-3
DAPI, cloridrato diidrico	Calbiochem	268298