Questo video illustra la tecnica per estrarre il DNA dalla specie di microbi residenti nel hindgut termite. La preparazione di un vetrino a fresco, che è utile per visualizzare la comunità microbica intestinale è anche illustrato, e un tour attraverso le specie di ambiente ricco di intestino è dato.
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Articolo metodologico
Estrazione del DNA da microbi intestinali della Termite (Zootermopsis Angusticollis) e visualizzare microbi intestinali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le termiti sono tra i pochi animali noti per avere la capacità di sussistere esclusivamente da legno consumando. Il tratto intestinale termite contiene una popolazione microbica densi e ricchi di specie che assiste nella degradazione della lignocellulosa prevalentemente in acetato, la sostanza nutriente chiave alimentando il metabolismo delle termiti (Odelson & Breznak, 1983). All'interno di queste popolazioni microbiche sono batteri, archeobatteri metanogeni e, in alcuni ("inferiore") termiti, eucarioti protozoi. Così, le termiti sono i soggetti di ricerca di eccellenza per lo studio delle interazioni tra le specie microbiche e le numerose funzioni biochimiche che svolgono a beneficio della loro ospite. La composizione delle specie delle popolazioni microbiche in budella delle termiti così come i geni chiave coinvolti in vari processi biochimici è stata esplorata mediante tecniche molecolari (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Queste tecniche dipendono dalla estrazione e purificazione degli acidi nucleici di elevata qualità dall'ambiente intestinale termite. La tecnica di estrazione descritta in questo video è una raccolta modificata di protocolli sviluppati per l'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici da campioni ambientali (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e produce DNA da materiale hindgut termite può essere utilizzato come modello per la reazione a catena della polimerasi (PCR).
Protocollo
Sintesi procedurale per tutta la termite-gut estrazione del DNA:
- Termiti freddo sul ghiaccio, rimuovere intestino utilizzando una pinzetta sterile e stabilizzare i campioni di intestino nel buffer.
- Omogeneizzare i campioni in PVPP / SDS / buffer fenolo.
- Estrarre e purificare il DNA da lisato grezzo con colonne Qiagen DNeasy.
Protocollo:
- Sul ghiaccio, rimuovere il fegato dalle termiti casta lavoratore con pinza sterile.
- Trasferire immediatamente il coraggio e contenuto in una sterile, priva di nucleasi tubo contenente 50 microlitri gelida 1x biologia molecolare grado di buffer TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Congelare i campioni a -20 ° C, o procedere direttamente con omogeneizzazione.
- Trasferire i campioni di intestino e ad un tampone sterile, priva di nucleasi 2 tubi ml con tappo a vite pre-caricato con 500 mg di sterili zirconia / perle di silice (0,1 mm) e 700 ml di tampone 1x TE contenente 1% w / v polivinilpolipirrolidone (PVPP ).
- Aggiungere 50 ml di solfato di sodio al 20% dodecil (SDS) e 500 ml di fenolo ai campioni.
- Omogeneizzare (battito tallone) sul più alto impostazione con tre cicli di 30 omogeneizzazione sec e 30 sec di raffreddamento sul ghiaccio.
- Sedimento materiale insolubile per 1 min a 8.000 x g.
- Purificare 300-microlitri aliquote del acquosa (superiore) strato con colonne Qiagen DNeasy con il metodo descritto per la purificazione lisato grezzo.
- Quantificare contenuto degli acidi nucleici e congelare i campioni a -20 ° C per un uso successivo.
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Discussione
Nella nostra esperienza, il DNA estratto dalle comunità microbiche del legno al seno specie di termiti come nevadensis Zootermopis è sufficientemente puro per il modello PCR dopo un giro di estrazione e purificazione. Tuttavia, alcuni termiti come lettiera al seno e il terreno al seno specie può avere una maggiore concentrazione di acidi umici nel loro contenuto intestinale e può richiedere ulteriore purificazione di DNA microbico intestinale. La resa del DNA totale dalle viscere di 5 lavoratori nevadensis Z. è nel range di 10-30 mg. Per le...
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| PVPP/SDS/fenolo | Tampone | tampone di omogeneizzazione | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Utilizzato secondo il protocollo per l'isolamento del DNA genomico da lisati grezzi (Appendice H, versione del manuale del prodotto: luglio 2003) |
| TE | Tampone | Sigma-Aldrich | T9285 | tampone 1x (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) ottenuto da concentrato 100x |
| perle di zirconia/silice | Materiali di consumo | Biospec Products | 11079101z | 0,1 mm |
| PVPP | Reagente | Sigma-Aldrich | P6755 | polivinilpolipirrolidone al 1% p/v preparato dal reagente secco come sospensione 1x in tampone TE |
| Zootermopsis nevadensis | Animale | Termiti | ||
| SDS | Reagente | Sigma-Aldrich | L4390 | solfato di sodio dodecile al 20% in soluzione acquosa, ottenuto dal reagente secco |
| Fenolo | Reagente | Sigma-Aldrich | 77607 | saturato con TE, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Strumento | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Soluzione salina tamponata, pH 7,2 | Formulazione per litro: 2,5 g K2HPO4, 1,0 g KH2PO4, 1,6 g KCl, 1,4 g NaCl, 0,075 g CaCl, 1 g MgCl e 10 mL di una soluzione 1 M di NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscopio | Carl Zeiss, Inc. | Dotato di obiettivo 40x, optivar 1,6x e lenti oculari 10x. I campioni sono stati osservati utilizzando l'illuminazione a contrasto di fase |
Riferimenti
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
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Ristampe e permessi
