Aptameri sono ribo-/deoxyribo-oligonucleotides corti selezionati In vitro Metodi evoluzione sulla base di affinità per un target specifico. Aptameri sono strumenti di riconoscimento molecolare con versatili applicazioni terapeutiche, diagnostiche e di ricerca. Dimostriamo metodi per la selezione di aptameri per la β-amiloide, proteina, l'agente eziologico della malattia di Alzheimer.
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Articolo metodologico
Selezione di Aptamers per β-amiloide proteina, l'agente eziologico della malattia di Alzheimer
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattia di Alzheimer (AD) è un progressista, età-dipendente, malattia neurodegenerativa con un corso insidioso che rende difficile la diagnosi presintomatica 1. DC diagnosi definitiva si ottiene solo post-mortem, stabilendo così presintomatica, diagnosi precoce di Alzheimer è cruciale per lo sviluppo e l'amministrazione terapie efficaci 2,3.
Proteina β-amiloide (Aβ) è fondamentale per la patogenesi dell'Alzheimer. Solubile, le assemblee oligomeriche Aβ si ritiene di influenzare neurotossicità sottostante disfunzione sinaptica e perdita di neuroni in AD 4,5. Varie forme di Aβ solubile assemblee sono stati descritti, tuttavia, le loro interrelazioni e la pertinenza ad eziologia e la patogenesi dC sono complessi e non ben compreso 6. Specifici strumenti di riconoscimento molecolare può svelare i rapporti tra assemblee Aβ e facilitare l'individuazione e caratterizzazione di queste assemblee nelle prime fasi del decorso della malattia prima che i sintomi emergere. Il riconoscimento molecolare si basa generalmente su anticorpi. Tuttavia, una classe alternativa di strumenti di riconoscimento molecolare, aptameri, offre importanti vantaggi rispetto agli anticorpi 7,8. Aptameri oligonucleotidi sono generate da in-vitro selezione: evoluzione sistematica dei ligandi di arricchimento esponenziale (SELEX) 9,10. SELEX è un processo iterativo che, simile a quello dell'evoluzione darwiniana, permette la selezione, l'amplificazione, l'arricchimento, e la perpetuazione di una proprietà, ad esempio, avido, specifico, di legame (aptameri) o l'attività catalitica (ribozimi e DNAzymes).
Nonostante la comparsa di aptameri come strumenti nel campo della biotecnologia moderna e della medicina 11, sono stati sottoutilizzati nel campo amiloide. RNA pochi o aptameri ssDNA sono stati selezionati contro varie forme di proteine prioniche (PrP) 12-16. Un aptamero RNA generati contro ricombinante PrP bovina ha dimostrato di riconoscere bovina PrP-β 17, una solubile, oligomerici, β-sheet ricco di variante conformazionale di full-length PrP che si forma fibrille amiloidi 18. Aptameri generati utilizzando forme monomeriche e molti dei β fibrillare sono stati trovati 2-microglobulina (β 2 m) per legare fibrille di alcune altre proteine amiloidogenica β oltre 2 m fibrille 19. Ylera et al. descritto aptameri RNA selezionato contro immobilizzato monomerico Aβ40 20. Inaspettatamente, queste aptameri legato fibrillare Aβ40. Complessivamente, questi dati sollevano diverse questioni importanti. Perché aptameri selezionati contro proteine monomeriche riconoscere loro forme polimeriche? Potrebbe aptameri contro le forme monomerica e / o oligomerici di proteine amiloidogenica ottenere? Per rispondere a queste domande, abbiamo cercato di selezionare aptameri per covalentemente stabilizzato oligomerici Aβ40 21 generati utilizzando foto-indotta cross-linking delle proteine non modificato (PICUP) 22,23. Simile a risultati precedenti 17,19,20, questi aptameri reagito con fibrille di altre proteine Aβ e diversi amiloidogenico probabilmente riconoscere un amiloide potenzialmente comuni strutturali aptatope 21. Qui, vi presentiamo la metodologia SELEX utilizzati nella produzione di questi aptameri 21.
Protocollo
Parte 1: preparazione di proteine e di cross-linking
Inizialmente, la proteina utilizzata per SELEX è pretrattati con 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) per ottenere omogeneo, aggregato senza preparazioni, come descritto in precedenza 23. Questo passaggio è necessario perché preformato aggregati indurre una rapida aggregazione di proteine amiloidogenica, con conseguente scarsa riproducibilità sperimentale 24, e sono indesiderabili per la selezione di aptameri per non aggregati, non fibrillare forme della proteina.
- Pesare ~ 800 mcg (~ 180 nmol) puro Aβ40 utilizzando una microbilancia. Trasferire i....
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Discussione
Il punto di partenza del processo di SELEX è sintesi di una libreria oligonucleotide casuale tipicamente contiene 10 12 -10 15 sequenze. Nel DNA SELEX, questa libreria è utilizzata direttamente dopo un pool di ssDNA viene generato, mentre in RNA SELEX, dimostrato qui, la biblioteca ssDNA viene convertito prima a un pool di RNA enzimaticamente da trascrizione in vitro. Poi, SELEX viene eseguito iterativamente per cui ogni ciclo comprende l'esposizione e vincolante di oligonucleotidi per.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni AG030709 dal NIH / NIA e 07-65798 del California Department of Public Health. Riconosciamo Margaret M. Condron per la sintesi di peptidi e analisi degli aminoacidi, la dottoressa Elizabeth F. Neufeld per aiutare e sostenere i passi iniziali del progetto, il Dr. B. Chi-Hong Chen di sostegno e di reagenti e Dr. Andrew D . Ellington per le discussioni utili.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Aβ40 | Laboratorio Biopolimeri UCLA | Polvere liofilizzata | |
| Microbilancia automatizzata MX5 | Mettler Toledo | ||
| Tubi da 1,6 ml rivestiti in silicio | Denville Scientific | C19033 o C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) | TCI America | H0424 | Utilizzare in una cappa chimica. |
| Peroxidisolfato di ammonio | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortexare fino a quando la soluzione non diventa limpida. Il APS viene preparato fresco ogni volta e deve essere utilizzato entro 48 h. |
| Tris(2,2-bipiridil)diclororutenio(II) esaidrato | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortexare fino a quando la soluzione non diventa limpida. Coprire il tubo di RuBpy con della stagnola per proteggere il reagente dalla luce ambiente. Il RuBpy viene preparato fresco ogni volta e deve essere utilizzato entro 48 h. |
| Ditiotreitolo (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| D-Salt™ Esceclosio™ colonne di desalazione | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| acetato di ammonio | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Tubi da 0,6 ml rivestiti in silicone | Denville Scientific | C19063 | |
| Novex Tricine Gel (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10 alveoli; formato mini (8 cm X 8 cm); 25 μvolume di caricamento l per pozzetto; intervallo di separazione da 5 kDa a 40 kDa |
| Cuvetta in quarzo | Hellma | 105.250-QS | |
| Beckman DU 640 spettrofotometro | Beckman Coulter Inc. | ||
| libreria di DNA a filamento singolo | Integrated DNA Technologies | Personalizzato su ordinazione | La libreria è stata progettata per contenere 49 nucleotidi casuali delimitati da due regioni costanti che includono siti di legame per primer e siti di clonaggio: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’ |
| Taq DNA polimerasi | USB Corp., Affymetrix | 71160 | Ricombinante Thermus aquaticus DNA polimerasi fornita con 10× Buffer PCR e un tubo separato di MgCl₂ 25 mM2 per PCR di routine. |
| Miscela di nucleotidi per PCR, soluzione 10 mM | USB Corp., Affymetrix | 77212 | (10 mM ciascuno di dATP, dCTP, dGTP, dTTP) |
| Primer diretto | Integrated DNA Technologies | Su richiesta | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| Primer inverso | Integrated DNA Technologies | Su ordinazione personalizzata | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| Termostato cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | Qiagen | 28104 | |
| Agarosio | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Tubi conici sterili da 1,6 ml con tappi provvisti di guarnizioni ad anello | Denville Scientific | C19040-S | |
| RiboMAX™ Sistema per la produzione su larga scala di RNA–T7 | Promega Corp. | P1300 | Il kit contiene: 120 μl'enzima mix (RNA polimerasi, RNasin ricombinante)® inibitore della ribonucleasi e pirofosfatasi inorganica ricombinante); 240 μtampone di trascrizione 5; 100 μl ciascuno dei 4 rNTP, 100 mM; 110 U di DNasi RQ1 priva di RNasi, 1 U/μl; 10 μDNA di controllo lineare, 1 mg/ml; 1 ml di acetato di sodio 3 M (pH 5,2); 1,25 ml di acqua priva di nucleasi |
| α-32P-citidina 5’-trifosfato, 250 μCi (9,25 MBq) | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | Attività specifica: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricina (pH 7,6) |
| Fenolo saturato con citrato:cloroformio:alcol isoamilico (125:24:1, pH 4,7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| Cloroformio:alcol isoamilo (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Etanolo assoluto per biologia molecolare | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Microcentrifuga refrigerata Z216-MK | Denville Scientific | C0216-MK | |
| illustra ProbeQuant™ Colonne micro G-50 | GE Healthcare | Ottenuto da Fisher Scientific (45-001-487) | Predisposto con Sephadex™ G-50 di grado DNA e pre-equilibrato in tampone STE contenente 0,15% di Kathon come biocida |
| Contatore a scintillazione da banco Triathler | Hidex Oy, Turku, Finlandia | Modello Triathler LSC: 425-034 | |
| Novex® TBE-Urea Buffer per Campioni (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| Gel al 6% TBE-urea, 1,0 mm, 10 pozzetti | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | |
| Decontaminante per radioattività | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| Punte per caricamento su gel | Denville Scientific | P3080 | |
| XCell SureLock Mini-cellula | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-cellula |
| Pellicola per autoradiografia | Denville Scientific | E3018 | Utilizzare al buio completo |
| Pellicola per autoradiografia, Hyperfilm™ ECL | Amersham | RPN3114K | Può essere utilizzato sotto luce rossa di sicurezza. |
| Dischi di membrana | EMD Millipore | GSWP02500 | Esteri misti di cellulosa, idrofili, 0,22-μmembrane dei dischi m |
| Base di supporto in vetro fritto per flacone da 125 ml | VWR international | 26316-696 | |
| Pietre di Petri | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | |
| Glicogeno | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-propanolo per biologia molecolare | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Inibitore ricombinante della RNasi | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| ImProm-II™Sistema di Trascrizione Inversa | Promega Corp. | A3802 | |
| Inibitore ricombinante della RNasi | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| RapidRun™ Colorante di Carico | USB Corp., Affymetrix | 77524 |
Riferimenti
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's d....
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Ristampe e permessi
