Flash Congelamento e criosezionamento E12.5 cervello di topo

Sommario

Dimostrato in questo video sono le tecniche per flash congelamento e sezionamento del tessuto embrionale del cervello di topo. Consigli utili per l'utilizzo del criostato sono dati, compresi i metodi di risoluzione dei problemi che possono essere utilizzati durante il taglio per assicurare che le sezioni risultanti tessuti sono privi di crepe e altre distorsioni.

Protocollo

1. Fissare il tessuto in paraformaldeide 4% in PBS per il tempo desiderato.
2. Saccarosio infondere tessuto (crioprotezione)
   1. Preparare la soluzione di saccarosio al 30% in PBS w / v nel 2059 tubo.
   2. Lavare il tessuto in PBS 3x (~ 5 min con dondolo).
   3. Tessuto posto in soluzione di saccarosio al 30%. Tessuto non affonderà.
   4. Posizionare il tessuto in 4 ° C durante la notte, o fino a quando è affondata.
3. Dimensione etichetta appropriata cryomold con informazioni e orientamento.
4. Riempire cryomold con OCT (evitare bolle).
5. Trasferimento di tessuto a bagno ottobre e il cappotto con ottobre
6. Trasferimento di tessuto da ottobre a cryomold.
7. Orientare il tessuto al microscopio.
8. Versare l'azoto liquido in plastica piastra di Petri.
9. Rapidamente e con attenzione abbassare il tessuto cryomold in azoto. (Non immergere la parte superiore del cryomold.)
10. Quando l'OCT è solido bianco, posto il tessuto congelato nel freezer -80 ° C per la conservazione.
11. Equilibrare tessuto a ~ 20 ° C per almeno 30 min. prima di sezionamento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stampo per criosezione Tissue-Tek	Ted Pella, Inc.	27181
O.C.T.	Ted Pella, Inc.	27050
Soluzione di saccarosio			soluzione di saccarosio al 30% in PBS p/v
paraformaldeide			paraformaldeide al 4% in PBS