Tecniche di Imaging Ca 2 + Segnalazione di sperma umano

Sommario

Stimolo-evocato [Ca ^{2 +}] I segnali dei singoli spermatozoi umani sono valutati. Cellule mobili sono caricati con Ca ^{2 +} Sensibili colorante fluorescente (AM-estere metodo) e immobilizzato in una camera perfusable. Le cellule sono ripreso dal time-lapse microscopia a fluorescenza e stimolato attraverso il medium di perfusione. Le risposte di singole cellule (o regioni) sono analizzati in linea con Excel.

Abstract

Microscopia a fluorescenza di cellule caricate con fluorescenti, Ca

Protocollo

Spermatozoi da soggetti sani fertile, con un esame dello sperma normale, sono normalmente preparati per l'imaging come segue.

1. Campioni di sperma sono conservati a 37 ° C per non più di 30 min. Le cellule sono isolate dal plasma seminale di nuotare fino in integrato la soluzione di Earle salina bilanciata (sEBSS; mM: 1,8 CaCl ₂ .2 H ₂ O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO ₄ 0,7 H ₂ O, 26,2 NaHCO _3, 1,0 NaH ₂ PO _4. 2H ₂ O, NaCl 116,4, 55,6 D-glucosio, piruvato 2,73 Na, 41,8 lattato Na) integrata con lo 0,3% carbone de-lipidated/fatty libero Frazione acido V BSA (qualità della BSA è cruciale per il successo di capacitazione dello sperma). 1 ml di sEBBS è pipettato in ciascuno di una serie di provette da 5 ml e delicatamente underlayered con 0,3 ml di sperma. Dopo l'incubazione per 1 ora (37 ° C, 6% di CO ₂₎ la parte superiore 0,7 ml viene delicatamente rimosso da ogni provetta e in pool. 10 microlitri della sospensione di spermatozoi viene diluito con 90 ml di 1% (v / v) formalina per immobilizzare le cellule, poi gli spermatozoi vengono conteggiati in una camera di Neubauer. Densità delle cellule nella sospensione viene quindi regolata (con sEBSS) a 6 milioni di cellule / ml.
2. Il campione viene quindi diviso in aliquote di 200 microlitri in tubi loosely-ricoperti e incubate (37 ° C, 6% di CO ₂₎ a per 5-6 h per consentire capacitazione.
3. Coprioggetti (22x50 mm) sono stati precedentemente trattati con poli-D-lisina. 10 ml di poli-D-lisina soluzione (10% w / v) viene applicato come un certo numero di piccole gocce al centro del vetrino. La poli-D-lisina è poi lasciati asciugare all'aria. Questo può essere su un palco riscaldato e deve essere a completo essiccamento. Un copri è attaccato con grasso per vuoto ad un chiuso, appositamente costruito, perfusable, policarbonato immagini da camera (dimensioni 35 mm x 20 mm x 5 mm; capacità ≈ 180 microlitri). Analoga alla camera di Warner RC20 La poli-D-lisina- coprioggetto rivestito costituisce la base della camera quando le cellule sono visualizzati su un microscopio invertito e una da 12 mm di diametro circolare coprioggetto forma la superficie superiore della camera, consente la trasmissione di luce.
4. Oregon verde BAPTA1-AM (OGB) o calcio Verde 1-AM sono usati per le cellule etichettatura. OGB si prepara sciogliendo in DMSO. Pluronic acido F127 (un detergente) è incluso nel DMSO per evitare 'aggregazione' del colorante. Questo può essere preparato in laboratorio (100 Pluronic mg in 0,5 ml di DMSO), immediatamente prima dell'uso, o può essere acquistato già pronto. 20 l è aggiunto ad una aliquota di OGB 50 mg (2,5 mg / ml). Il flaconcino può essere quindi conservati congelati e scongelati per un uso successivo.
5. Dopo la capacitazione dello sperma (5-6 h in sEBBS, 37 ° C, 6% di CO ₂₎ è stato selezionato un tubo per l'imaging e 1,2 ml di soluzione OGB si aggiunge, dando una concentrazione finale di 10 micron. Il tubo viene quindi incubato per altri 40 minuti, dopo di che la sospensione cellulare viene iniettata dolcemente nella porta della camera di afflusso di immagini con un p1000 (blu) puntale. La camera si trova nel lato coprioggetti incubatore, poli-D-lisina rivestite in giù, per 20 minuti. Cellule tendono a nuotare lungo le superfici della camera e aderire al poli-D-lisina rivestite zona.
6. La camera è ora montato sul microscopio, sono collegati agli apparecchi e perfusione perfuso a circa 0,5 ml / min. Una pompa a rulli alimenta salina nella camera e troppo pieno dalla porta di uscita viene rimosso da una pompa di aspirazione con trappola. La preparazione è lasciato al buio per almeno 10 minuti, mentre le cellule sciolte e tintura extracellulare vengono rimossi dalla perfusione della camera. Stabilità della temperatura è di fondamentale importanza perché piccole fluttuazioni non possono incidere solo sul cellulare di Ca ^{2 +} omeostasi, ma può colpire anche K _d del colorante. Gli esperimenti sono normalmente effettuate a 25 ° C, ottenuta mantenendo la temperatura della stanza buia a questo livello. Abbiamo scoperto che mantenere la temperatura ambiente al livello richiesto offre una maggiore stabilità di temperatura e attenzione rispetto all'utilizzo di una fase a temperatura controllata o di un riscaldamento termostatato sull'afflusso salina.
7. Le cellule sono visualizzati in contrasto di fase (40x o 60x ad immersione in olio) obiettivo e un'area per l'imaging è selezionata. La porzione di poli-D-lisina zona rivestita che è vicino alla porta d'ingresso è preferito, dove il flusso salino è laminare e coerente. E 'inoltre importante utilizzare una zona dove la densità delle cellule è appropriata (densità eccessiva influisce sulla qualità e integrità dei dati attraverso la ripresa del segnale da celle adiacenti) e dove le cellule sono adeguatamente collegati, ma l'attività flagellare è visibile. Un'immagine contrasto di fase è salvato. Il microscopio è poi passa alla modalità a fluorescenza (eccitazione 480 nm, emissione di 540 nm) e di esposizione sia ridotto al minimo il tempo necessario per ottenere una chiara immagine di fluorescenza (di solito 50-200 ms).
8. L'esperimento è iniziato da tempo attivando la serie software di acquisizione immagini (IQ). Di solito le immagini sono acquisite a 0,1 Hz e l'illuminazione è limitato ai periodi di acquisizione di immagini solo usando un Software otturatore controllato. Maggiore velocità di acquisizione dell'immagine può essere utilizzato, ma occorre tener conto per problemi di sbiancamento e la generazione di artefatti dovuti a foto-danni alle cellule (vedi discussione). IQ (e la maggior parte altre piattaforme software di acquisizione) consentirà in tempo reale, grafici di fluorescenza durante l'esperimento.
9. Dopo un periodo di controllo di 3-5 minuti Durata manipolazione di costituenti salini (come ad esempio [Ca ^{2 +]} _o) e l'applicazione di farmaci si ottiene la sostituzione di soluzione salina nell'intestazione perfusione. Tempo di aggiunta di ogni stimolo è notato in modo che l'orario di arrivo nella camera di imaging può essere calcolato, garantendo precisione sufficiente per la valutazione delle risposte lento qui descritti (campionato a 0,1 Hz). Per le risposte più rapide maggiore precisione si può ottenere con l'aggiunta di stimoli direttamente al flusso di soluzione salina attraverso una porta afflusso secondo quanto previsto nel RC20 Warner camera.
10. Le immagini sono analizzate in linea con IQ. Regioni di interesse (ROI) sono del giro ogni cella (o parte di cellulari) e anche una zona cella libera è selezionata (per la sottrazione del fondo automatico dal software. La serie di immagini viene poi controllato per rimuovere le cellule che sono morti o sono stati sottoposti reazione acrosomiale ( che appare come un consistente e rapido aumento della fluorescenza seguita dalla perdita di colorante citoplasmatica) durante l'esperimento e quelli che hanno mostrato il movimento sufficiente a causare artefatti quando analizzata come una serie temporale.
11. Un tempo-fluorescenza serie intensità è poi ottenuto per ogni ROI e questi dati vengono analizzati in linea in Excel. Inizialmente fluorescenza è normalizzato al valore medio ottenuto durante il periodo di controllo, utilizzando l'equazione R = [(FF _riposo) / F _resto] x 100%, dove R è il cambiamento della fluorescenza% rispetto al periodo di controllo,, F è l'intensità di fluorescenza in un tempo t ed il _resto F è la media di almeno 30 determinazioni di F ottenuti durante il periodo di controllo.

Rappresentante Risultati

La figura 1 mostra una serie di immagini da un esperimento in cui le cellule sono state stimolate con 3 mM progesterone. La riga superiore e film 1 mostrano le immagini di fluorescenza in scala di grigi e la stessa maghi sono riportati di seguito (e nel film 2) in pseudocolori ('16_colors lookup table 'in Image J), ​​dove' cool 'colori indicano bassa intensità e fluorescenti 'caldi' colori indicano alta intensità di fluorescenza. Le celle possono essere visualizzati in pseudocolore durante l'esperimento, utilizzando tabelle di ricerca in intelligenza, ma con scala di grigi è generalmente più informativo per la valutazione. Se le cellule sono ben etichettati. Le prime due immagini sono state raccolte a 0 s e 100 s dopo l'inizio della registrazione. Fluorescenza deve essere stabile e tende ad essere più forti nella zona posta acrosomiale e del collo sperma. Il progesterone è entrato nella camera di imaging a circa 175 s ed il 3 ^° e 4 ^° delle immagini (180 s e 220 ​​s) mostra un rapido aumento della [Ca ^{2 +] i} (fluorescenza) originarie della testa e del collo posteriore della cellula. Immagini successive sono a 290, 360, 740, 990 e 1440 s, mostrando il decadimento del periodo iniziale di [Ca ^{2 +]} i transitori e lo sviluppo di una elevazione secondaria sostenuta. La figura 2 mostra un'analisi foglio di calcolo, di conversione raw valori di fluorescenza per ogni ROI a fluorescenza normalizzata (variazione% della fluorescenza rispetto al periodo di controllo) La figura 3 mostra trame fluorescenza tempo normalizzato per 3 celle che mostrano 'tipico' risposte a 3 mM progesterone.

Figura 1. Esempio di dati da una cella stimolati con progesterone. Una serie di immagini di fluorescenza in scala di grigi (riga superiore) e pseudocolori (fila inferiore) sono mostrati. Punti di tempo sono 0, 180, 220, 290, 360 e 990. 3 progesterone microM entrato nella camera di imaging a 175 s. ROI sono mostrati nel primo pannello.

Figura 2. Analisi dei dati singoli fluorescenza cella in Excel. Figure in nero sono serie temporali di dati di fluorescenza, disposti verticalmente. I valori in rosso (sotto) sono dati normalizzati ottenuti usando l'equazione data nel testo. Il grafico mostra normalizzato fluorescenza in tempo trama per 64 celle in questo esperimento che, su stimolo, mostra un aumento transitorio della fluorescenza seguita da una crescita lenta e una serie di piccole oscillazioni.

Figura 3. Fluorescenza in tempo le tracce per 3 celle individuali, espresso come variazione% rispetto al valore di controllo .. 3 mM progesterone è stato aggiunto al momento segnato dalla freccia. Mostra la linea tratteggiata significa fluorescenza di controllo.

Discussione

Se eseguite con successo, questa tecnica permette di registrare la distribuzione e la cinetica di spontaneo e indotto Ca ^{2 +} segnali di sperma umano. Le risposte possono essere ottenute da un gran numero di cellule (fino a 200) che è importante in quanto lo sperma umano può mostrare un sacco di variazione nella loro spontanea e stimolata Ca ^{2 +} segnali. L'etichettatura di successo e la sopravvivenza delle cellule durante la registrazione sono altamente dipendenti sulla qualità del campione. Campioni poveri danno etichettatura poveri, le risposte poveri e le cellule possono morire durante la registrazione.

Spermatozoi umani sono molto sensibili al foto-danni e quindi utilizzare l'illuminazione minima necessaria (sia l'intensità e tempo di esposizione) al fine di massimizzare la sopravvivenza cellulare e ridurre al minimo gli artefatti dovuti alla morte delle cellule. Una telecamera ad alta sensibilità (permettendo l'uso di illuminazione a bassa intensità) è un grande vantaggio in quanto la telecamera riprenderà fluorescenza debole. Retro-illuminato, EM-CCD sono particolarmente adatti, anche se molto costoso. Illuminazione a LED (invece di utilizzare una lampada allo xeno o mercurio con filtro di eccitazione migliora anche la sopravvivenza delle cellule (Nishigaki et al, 2006).

Non usiamo Fura-2, nonostante i vantaggi evidenti del rapporto-metrica delle immagini, perché Fura richiede l'eccitazione con luce UV e perché è necessario prendere due immagini per ogni rapporto. Per i dati ottenuti con singola lunghezza d'onda, coloranti luce visibile, la normalizzazione della fluorescenza compensa ampiamente la differenza di carico colorante tra le cellule, ma non per la distribuzione colorante all'interno di una singola cellula, e questo deve essere tenuto presente. Sebbene coloranti singola lunghezza d'onda può, in linea di principio, essere calibrato, l'accuratezza della tecnica è scarsa e non tentiamo di fare questo.

Considerando che i dati ottenuti con rapporto di Fura-2 (o l'emissione rapporto colorante indo), anche senza calibrazione, dare una rappresentazione accettabile fedele di variazioni relative a [Ca ^{2 +]} i, l'intensità di fluorescenza dei coloranti singola lunghezza d'onda è tutt'altro che linearmente relative alla [Ca ^{2 +]} i. Sopra la parte più utile della curva di saturazione del rapporto per le tinture singola lunghezza d'onda si avvicina di solito a logaritmica. Al momento stiamo utilizzando Oregon Verde Bapta-1 (Figura 4), ​​perché è sensibile alle piccole variazioni [Ca ^{2 +]} i di riposo vicino al livello s (50-100 nM). Quando [Ca ^{2 +]} i supera 1 risposte microM saranno sottorappresentati in termini di cambiamento di fluorescenza e il colorante può saturare. Un'opzione per il miglioramento della tecnica senza ricorrere a eccitazione UV è di raddoppiare celle di carico con un colorante come Fluo-3 e Fura rosso. Entrambi possono essere eccitato a 488 nm, ma contemporaneamente le loro risposte sono molto diverse. Registrazione di emissione a 540 e 650 nm fornisce un rapporto che può fornire un metodo migliore per un accurato monitoraggio di [Ca ^{2 +]} i (Haughland, 2002) e possono essere applicabili allo sperma (Nisigaki et al, 2006).

Figura 4. Relazione tra libera [Ca ^{2 +]} (nm) ed emissione di fluorescenza a lunghezza d'onda massima (circa 525 nm) per Oregon Verde Bapta-1 e Oregon verde Bapta-2. OGB1 dà una maggiore fluorescenza a riposo [Ca ^{2 +]} ma satura a livelli più bassi e quindi ha un range più piccolo utilizzabile. Dati per tali appezzamenti sono stati ottenuti dal Molecular Probes manuale (Haughland, 2002).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Basso livello di luce Fotocamera	QImaging	Rolera XR
Oregon Green BAPTA-1	Invitrogen	06807
Software di imaging	Andor	IQ
Software	di imaging National Institutes of Health	Image J	Software di pubblico dominio
Sistema di illuminazione a LED	Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127 (soluzione al 20% in DMSO)	Invitrogen	P3000MP