$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Questo protocollo è un estratto da Sarasija e Norman, Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in Caenorhabditis elegans intatta, J. Vis. Exp. (2019).
1. Crescita e sincronizzazione della popolazione di nematodi
Questi animali raggiungeranno lo stadio larvale L4 dopo ~42 ore. A questo punto, spostare le larve L4 utilizzando un plettro di platino su piastre NGM con semina OP50 contenenti 0,5 mg/mL di 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUdR) per evitare che producano progenie.
NOTA Assicurati che all'interno di un esperimento tutte le deformazioni siano sincronizzate per un periodo di tempo simile. Il trattamento FUdR sterilizza gli animali e previene la deposizione delle uova e la produzione di progenie, che potrebbero influenzare l'OCR. Questi animali sterilizzati saranno analizzati il giorno successivo (giorno 1 animali adulti a ~66 h) per il test. È stato riportato che la FUdR influisce sulla fisiologia e sulla durata della vita di alcuni vermi mutanti. Pertanto, questo dovrebbe essere preso in considerazione quando il farmaco viene utilizzato per la sterilizzazione. I vermi possono anche essere sterilizzati per mezzo di mutazioni femminizzanti come fem-1 (hc17) o fem-3 (e2006). Tuttavia, queste mutazioni potrebbero influire sulla funzione mitocondriale.
- Trasferire larve L4 del background genetico desiderato (ad esempio, N2 [wild type] e sel-12 animali) su piastre di terreno di crescita per nematodi (NGM) (vedi Tabella 1 per la ricetta) appena seminate con un prato di Escherichia coli (OP50). Utilizzare almeno due piastre da 100 mm o tre da 60 mm per ogni ceppo. Incubare i vermi alla temperatura di crescita appropriata (tra 15-25 °C) per 3-4 giorni o fino a quando le piastre non si sono concentrate con un gran numero di uova e vermi gravidi.
- Lavare le uova e i vermi dalle piastre utilizzando circa 6 ml di tampone M9 (vedere la Tabella 1 per la ricetta) per piastra da 100 mm di nematodi e trasferirli con pipette di vetro Pasteur in singole provette da centrifuga da 15 ml per ogni ceppo. Centrifugare questi tubi verso il basso per 3 minuti a 6.180 x g e aspirare il tampone M9, trattenendo solo gli animali e le uova.
- Aggiungere 3-4 mL di soluzione di candeggina (vedere la Tabella 1 per la ricetta) in ciascuna provetta e agitare a intermittenza per 6 minuti. Aggiungere il tampone M9 per riempire ciascuna provetta e centrifugare a 6.180 x g per 1 minuto e aspirare il surnatante. Ripetere questo lavaggio con M9 tre volte e spostare il pellet d'uovo in una provetta fresca da 15 ml contenente circa 9 ml di tampone M9.
- Sincronizzare i vermi appena nati nuttandoli a 20 °C per 16-48 ore. Centrifugare questi tubi a 6.180 x g per 1,5 minuti e mettere gli animali L1 sincronizzati su singole piastre NGM appena seminate con un prato di OP50 (circa 6.000-10.000 animali per piastra da 100 mm) e mantenerle a 20 °C.