Generazione di sferoidi da linee cellulari: un metodo di coltura cellulare tridimensionale (3D)

1. Generazione di sferoidi da una linea cellulare di cancro del colon-retto

1. Lavare i monostrati cellulari HCT 116 (trasdotto stabilmente per esprimere il cluster di differenziazione 19 (CD19) e la proteina di fluorescenza verde (GFP)) con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 5 mL per un pallone da 25 cm² o 10 mL per un matraccio da 75 cm²). Aggiungere la tripsina (0,5 mL per un pallone da 25 cm² o 1 mL per un pallone da 75 cm²) e incubare le cellule a 37 °C per 5 min.
2. Controllare il distacco cellulare al microscopio e neutralizzare l'enzima di dissociazione cellulare con il terreno completo del Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamicina; 10 mL per un pallone da 25 cm² o 20 mL per un pallone da 75 cm²).
3. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere pipettando su e giù più volte con 5 mL di terreno RPM1 1640 completo.
4. Contare le celle utilizzando l'esclusione del blu di tripano su un contatore di celle compatibile.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere in terreno RPMI per ottenere 5 x 10³cellule/mL.
6. Rivestire una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di 100 μg/mL di poli-L-lisina (PLL) in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare due volte con PBS e lasciare asciugare la piastra.
7. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio sterile ed erogare 200 μL/pozzetto nelle piastre a fondo rotondo a 96 pozzetti rivestite con PLL utilizzando una pipetta multicanale.
8. Trasferire la piastra nell'apparecchio di imaging automatizzato all'interno di un'incubatrice (37 °C, 5% CO₂, 95% di umidità).
9. Accedi al software di acquisizione, seleziona Programma di acquisizione | Avvia Aggiungi nave | Scansiona in base al programma | Crea nave: Nuovo.
10. Seleziona il tipo di scansione: Sferoide. Selezionare i canali di interesse: Fase + Campo chiaro (per seguire la crescita degli sferoidi), Verde (per seguire il segnale tumorale, tempo di acquisizione 300 ms) e Rosso (per seguire l'apoptosi, tempo di acquisizione 400 ms).
    1. Selezionare l'ingrandimento desiderato: 10x.
    2. Scegliete il modello di piastra e la sua posizione nel cassetto. Selezionare la posizione dei pozzetti da riprodurre. Inserisci la descrizione dell'esperimento: nome, tipo di celle, numero di celle.
11. Per l'impostazione dell'analisi, selezionare Rinvia analisi a un momento successivo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale e selezionare l'opzione Imposta intervallo gruppo di scansione selezionatoe impostare Aggiungi scansioni ogni 4 ore e Per un totale di 24 ore. Impostare l'ora di inizio desiderata (almeno 1 ora dopo l'incubazione nell'apparecchio di imaging automatizzato).
12. Controlla ogni 2 giorni la crescita degli sferoidi accedendo al software di imaging.
    1. Scegli l'opzione Visualizza scansioni recenti e fai doppio clic sull'esperimento desiderato. Selezionate Campo chiaro nel pannello dei canali dell'immagine, quindi utilizzate lo strumento Misura funzioni immagine per misurare il diametro degli sferoidi. Occorrono 6 giorni perché uno sferoide raggiunga la dimensione desiderata: 0,5 mm di diametro. Aggiungere 50 μl di terreno RPMI completo per pozzetto al giorno 4 per limitare l'effetto di evaporazione del mezzo.