Generazione di sferoidi da linee cellulari: un metodo di coltura cellulare tridimensionale (3D)

Abstract

Fonte: Dillard, P., et al. Un saggio di uccisione degli sferoidi da parte delle cellule T CAR. J. Vis. Exp. (2018).

Gli sferoidi sono un tipo di modello di coltura cellulare 3D utilizzato per rappresentare in modo più accurato l'ambiente di una cellula rispetto ai modelli monostrato di coltura cellulare 2D. Nel protocollo di esempio, vedremo gli scienziati generare sferoidi da una linea cellulare di cancro del colon-retto e applicare l'imaging di cellule vive per monitorare la crescita degli sferoidi.

Protocollo

1. Generazione di sferoidi da una linea cellulare di cancro del colon-retto

1. Lavare i monostrati cellulari HCT 116 (trasdotto stabilmente per esprimere il cluster di differenziazione 19 (CD19) e la proteina di fluorescenza verde (GFP)) con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 5 mL per un pallone da 25 cm² o 10 mL per un matraccio da 75 cm²). Aggiungere la tripsina (0,5 mL per un pallone da 25 cm² o 1 mL per un pallone da 75 cm²) e incubare le cellule a 37 °C per 5 min.
2. Controllare il distacco cellulare al microscopio e neutralizzare l'enzima di dissociazione cellulare con il terreno completo del Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamicina; 10 mL per un pallone da 25 cm² o 20 mL per un pallone da 75 cm²).
3. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere pipettando su e giù più volte con 5 mL di terreno RPM1 1640 completo.
4. Contare le celle utilizzando l'esclusione del blu di tripano su un contatore di celle compatibile.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere in terreno RPMI per ottenere 5 x 10³cellule/mL.
6. Rivestire una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di 100 μg/mL di poli-L-lisina (PLL) in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare due volte con PBS e lasciare asciugare la piastra.
7. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio sterile ed erogare 200 μL/pozzetto nelle piastre a fondo rotondo a 96 pozzetti rivestite con PLL utilizzando una pipetta multicanale.
8. Trasferire la piastra nell'apparecchio di imaging automatizzato all'interno di un'incubatrice (37 °C, 5% CO₂, 95% di umidità).
9. Accedi al software di acquisizione, seleziona Programma di acquisizione | Avvia Aggiungi nave | Scansiona in base al programma | Crea nave: Nuovo.
10. Seleziona il tipo di scansione: Sferoide. Selezionare i canali di interesse: Fase + Campo chiaro (per seguire la crescita degli sferoidi), Verde (per seguire il segnale tumorale, tempo di acquisizione 300 ms) e Rosso (per seguire l'apoptosi, tempo di acquisizione 400 ms).
    1. Selezionare l'ingrandimento desiderato: 10x.
    2. Scegliete il modello di piastra e la sua posizione nel cassetto. Selezionare la posizione dei pozzetti da riprodurre. Inserisci la descrizione dell'esperimento: nome, tipo di celle, numero di celle.
11. Per l'impostazione dell'analisi, selezionare Rinvia analisi a un momento successivo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale e selezionare l'opzione Imposta intervallo gruppo di scansione selezionatoe impostare Aggiungi scansioni ogni 4 ore e Per un totale di 24 ore. Impostare l'ora di inizio desiderata (almeno 1 ora dopo l'incubazione nell'apparecchio di imaging automatizzato).
12. Controlla ogni 2 giorni la crescita degli sferoidi accedendo al software di imaging.
    1. Scegli l'opzione Visualizza scansioni recenti e fai doppio clic sull'esperimento desiderato. Selezionate Campo chiaro nel pannello dei canali dell'immagine, quindi utilizzate lo strumento Misura funzioni immagine per misurare il diametro degli sferoidi. Occorrono 6 giorni perché uno sferoide raggiunga la dimensione desiderata: 0,5 mm di diametro. Aggiungere 50 μl di terreno RPMI completo per pozzetto al giorno 4 per limitare l'effetto di evaporazione del mezzo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
La soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Numero di lotto: RNBG7037
75 cm² fiaschette per l'area di crescita	VWR	430639	Numero di lotto: 2218002
75 cm² fiaschette per l'area di crescita	VWR	734-2705	Numero di lotto: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Numero di lotto: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutammina, 10 x 500 mL	Tecnologia di vita (Gibco)	Codice 21875-091	Numero di lotto: 1926384
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Numero di lotto: 1904924A
Soluzione blu di tripano, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Numero di lotto: 1886513
Piastra da 96 pozzetti, fondo rotondo	VWR	734-1797	Numero di lotto: 33117036
X-VIVO 15 con Gentamicina L-Gln, Rosso Fenolo, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Numero di lotto: 8MB036
Serbatoio dei reagenti	VWR	Codice 89094-672	Numero di lotto: 89094-672
15 mL di provette	VWR	734-1867	Numero di lotto: 19317044
Siero Bovino Fetale	Gibco	10500064	Numero di lotto: 08Q3066K
HCT 116 Linea di Carcinoma Colorettale	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience