Questo protocollo è un estratto da Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).
1. Preparazione delle larve
- Due o più giorni prima di iniziare il saggio, impostare gli incroci delle combinazioni sperimentali e di controllo desiderate (minimo 20 femmine e 10 maschi ciascuno) in piastre per la deposizione delle uova come descritto da Wieschaus e Nusslein-Volhard, ma utilizzando becher in polipropilene da 50 ml e piastre di Petri monouso da 6,0 cm contenenti agar d'uva e spalmate con pasta di lievito appena prima dell'uso. Conserva le mosche nei piatti per deporre le uova al buio a temperatura ambiente fino al momento del bisogno.
- Ricetta dell'agar d'uva: unire 100 ml di concentrato di succo d'uva congelato al 100%, 350 ml di acqua deioinizzata, 5 ml di acetico glaciale e 13 g di agar D. melanogaster in un becher di vetro da 1 litro. Microonde in raffiche di 1-2 minuti, mescolando tra una raffica e l'altra, fino a quando l'agar non è tutto sciolto. Raffreddare la soluzione per alcuni minuti, quindi aggiungere 10 mL di Nipagen al 10% (p/v) (metil-p-idrossibenzoato) in etanolo al 95%. Mescolare, quindi pipettare 7 mL per piastra in piastre di Petri monouso da 6,0 cm, lasciare gelificare e asciugare a temperatura ambiente per 3-4 ore. Conservare a 4 °C in sacchetti di plastica.
- Ricetta pasta di lievito – 7 g di lievito secco, 10 ml di acqua deionizzata, mescolare con una spatola fino a ottenere una consistenza uniforme.
- Raccolte di uova a tempo per generare larve sperimentali e di controllo. Utilizzando nuovi piatti d'uva spalmati di lievito, raccogliere le uova a temperatura ambiente per 4 ore al buio durante le ore mattutine. Rimuovere queste piastre di raccolta 4 h e sostituirle con piastre nuove. Incubare le piastre di raccolta per 4 ore per una notte a 25 °C fino al pomeriggio del giorno successivo, quando la maggior parte delle larve si sarà schiusa. Raccogli queste prime larve di stadio e usali per organizzare l'esperimento.
2. Impostazione delle piastre di analisi
- Preparazione di piastre di analisi. Per una singola esecuzione del saggio, preparare cinque piastre di saggio ciascuna di 10 larve sperimentali e cinque piastre di 10 larve di controllo. Usa una trivella di sughero da 1,5 cm per rimuovere un nucleo centrale di agar da ogni piatto creando un foro per il cibo. Mettere la pasta di lievito (0,8 - 0,9 g) nel foro e picchiettare delicatamente con una spatola per formare un mucchio riempiendo il buco.
- Preparazione della piastra di agar – unire 700 ml di acqua deionizzata con 16 g di agar D. melanogaster in un becher di vetro da 2 litri e cuocere nel microonde per 5 minuti. Togliere dal microonde e mescolare con una bacchetta di vetro per introdurre l'agar non disciolto nella soluzione. Aggiungere 17,5 ml di Nipagen al 10% (p/v) in etanolo al 95%, mescolare, quindi continuare il riscaldamento a microonde in raffiche di 30 secondi seguite da agitazione, fino a quando tutto l'agar è completamente sciolto. Raffreddare per un minuto o due, quindi pipettare 15 mL di aliquote in piastre di Petri di plastica da 10 cm. Lasciare gelificare l'agar, coprire i piatti con i coperchi e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per alcune ore o durante la notte. Conservare le piastre in sacchetti di plastica sigillati a 18 °C.
NOTA 1: Per evitare la formazione di cristalli di Nipagen sulla superficie delle piastre a causa di un'eccessiva essiccazione, utilizzare le piastre entro pochi giorni dalla preparazione. Se necessario, i cristalli possono essere nuovamente sciolti facendo cadere su di essi alcuni microlitri di alcol al 95%.
NOTA 2: i lotti di agar possono avere diverse proprietà gelificanti. Le piastre di gel asciutto devono essere solide al tatto e sufficientemente resistenti da poter rimuovere un cerchio pulito e intatto di agar quando si utilizza la piralide del sughero per creare il foro del cibo (vedi sopra).
- Impostazione delle larve nelle piastre di analisi. Usa la pressione meccanica per curvare la punta di una microspatola di plastica e immergi la punta nella pasta di lievito per fornire "adesivo" per raccogliere le larve. Raccogli le larve di primo stadio individualmente e posizionale sulla piastra di agar vicino al tumulo di cibo. Preparare almeno cinque piastre replicate di 10 larve sia per i genotipi sperimentali che per quelli di controllo. Una volta completato, tappare ed etichettare ogni piastra e posizionare le piastre (con il coperchio rivolto verso l'alto) in uno spazio buio a temperatura ambiente (nel nostro laboratorio è di 22 °C).
3. Monitoraggio delle piastre di analisi
- Esamina le piastre ogni giorno al microscopio da dissezione e registra il numero di larve sopra il cibo o sulla superficie dell'agar. Notare eventuali larve morte o morenti visibili. Si noti quando e se si osserva un tunnel nel substrato dell'agar mentre le larve si spostano nel terzo stadio. Annotare le date in cui le pupe iniziano a formarsi e annotare eventuali anomalie pupali. Continuare le osservazioni quotidiane fino a quando tutte le larve sono morte o impupate.
- Rimuovere con cura le pupe dal piatto con un ago da presa piegato e trasferirle su un piatto d'uva. Se lo si desidera, continuare a monitorare le pupe per determinare quante si chiudono da adulte.
