drosofila Dissezione del disco immaginale larvale: un metodo per osservare lo sviluppo degli epiteli

Abstract

Fonte: Morimoto, K. e Tamori, Y. Induzione e diagnosi dei tumori negli epiteli del disco immaginale di Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Quando si colorano i dischi immaginali di Drosophila, spesso viene eseguita una dissezione grossolana in cui i dischi sono esposti ma rimangono attaccati al corpo. Una volta colorati, i dischi di interesse vengono isolati e montati. Il protocollo di esempio dimostra una procedura per la dissezione e il montaggio del disco immaginale dell'ala.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Morimoto e Tamori, Induzione e diagnosi di tumori negli epiteli del disco immaginale di Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).

1. Dissezione delle larve

1. Raccogliere le larve vaganti del terzo stadio con un bastoncino di legno o una pinza smussata, genotipizzarle con marcatori fluorescenti appropriati (ad esempio, EGFP) sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza e metterle in una capsula di dissezione con PBS (soluzione salina tamponata con fosfato).
2. Lavare le larve in PBS mediante pipettaggio con pipette di trasferimento in plastica da 2 mL.
3. Pizzicare il centro della larva con una pinza e strappare il corpo a metà con l'altra pinza.
4. Pizzicare il gancio della metà anteriore con una pinza e spingere la bocca verso il corpo con l'altra pinza per capovolgere il corpo.
5. Rimuovere i materiali non necessari come le ghiandole salivari o i corpi adiposi con una pinza.

2. Fissazione e colorazione degli anticorpi

1. Trasferire la metà anteriore sezionata del corpo larvale (compresi i dischi alari immaginali) in una provetta di plastica da 1,5 mL e fissare in 1 mL di soluzione Fix (4% di formaldeide in PBS) per 10 minuti a temperatura ambiente al buio con una leggera rotazione.
   cautela: La formaldeide è tossica e ha un potenziale cancerogeno. Indossare guanti e indumenti protettivi per evitare il contatto con la pelle.
   NOTA: In questa parte, tutti i passaggi si svolgono su un nutatore a temperatura ambiente al buio, se non diversamente specificato.
2. Rimuovere la soluzione Fix e gettarla. Lavare i fazzoletti con 1 mL di PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) tre volte per 15 minuti ciascuno.
3. Rimuovere il PBT e aggiungere 1 mL di PBTG (0,2% di albumina sierica bovina e 5% di siero di capra normale in PBT) per il blocco e nutato 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
4. Rimuovere il PBTG e aggiungere la soluzione di anticorpi primari opportunamente diluita con PBTG (vedere la Tabella dei materiali) e il nutato per una notte a 4 °C.
5. Rimuovere la soluzione di anticorpi primari e lavare i fazzoletti con 1 mL di PBT tre volte per 15 minuti ciascuno.
6. Rimuovere il PBT e aggiungere una soluzione di anticorpi secondari opportunamente diluita con PBTG (1:400). Nutare per 2 h a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
7. Rimuovere la soluzione di anticorpi secondari e lavare i fazzoletti con 1 mL di PBT due volte per 15 minuti ciascuno.
8. Per colorare la F-actina, rimuovere il PBT e aggiungere la soluzione di falloidina opportunamente diluita in PBS (1:40). Quindi nutare per 20 min. Rimuovere la soluzione di falloidina e lavare i fazzoletti con 1 mL di PBT due volte per 15 minuti ciascuno.
9. Per controcolorare il DNA nucleare, rimuovere il PBT e aggiungere la soluzione DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilidolo) (0,5 μg/mL di DAPI in PBS). Quindi nutato 10 min.
   cautela: Il DAPI ha un potenziale cancerogeno. Indossare guanti e indumenti protettivi per evitare il contatto con la pelle.
10. Rimuovere la soluzione DAPI e lavare i fazzoletti con 1 mL di PBT due volte per 15 minuti ciascuno.
11. Sciacquare una volta in 1 mL di PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
12. Rimuovere il PBS e aggiungere 500 μl di glicerolo al 100% come mezzo di premontaggio.

3. Montaggio su vetrini per microscopio

1. Posizionare i tessuti colorati su un vetrino da microscopio utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da 2 mL.
2. Trasferire i tessuti in gocce di terreno di montaggio su un altro vetrino da microscopio con una pinza.
3. Tenere premuta l'estremità del tessuto sezionato con una pinza e tirare via i dischi antennali del cervello e dell'occhio con l'altra pinza.
   NOTA: Tenete i cervelli sezionati per posizionarli vicino ai dischi immaginali delle ali. I cervelli fungono da piattaforma che impedisce al vetrino coprioggetto di schiacciare i dischi immaginali delle ali.
4. Per isolare l'ala, i dischi immaginali tengono premuta l'estremità del tessuto sezionato con una pinza e graffiano delicatamente la parete del corpo e strappano i dischi con l'altra pinza.
   NOTA: Se è difficile trovare i dischi immaginali delle ali, sbucciare la trachea dal lato posteriore a quello anteriore. I dischi immaginali delle ali si attaccano alla trachea.
5. Coprire delicatamente i dischi immaginali con un vetrino coprioggetti e sigillare con smalto per unghie; conservare a 4 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Wako	Codice 162-19321
TritonX-100	Wako	Codice 168-11805
Formaldeide	Wako	Codice 064-00406
albumina sierica bovina	sigma	Codice: A7906
siero di capra normale	sigma	G6767
supporto di montaggio, Vectashield	Laboratori Vector	H-1000
DAPI	sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	Anti-dischi 4F3 di grandi dimensioni, RRID:AB_528203	diluire in PBTG, 1:40
per topolino-anti-MMP1	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	3A6B4, RRID:AB_579780	3 miscelati 1:1:1 e diluiti in PBTG, 1:40
per topolino-anti-MMP1	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	3B8D12, RRID:AB_579781	3 miscelati 1:1:1 e diluiti in PBTG, 1:40
per topolino-anti-MMP1	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	5H7B11, RRID:AB_579779	3 miscelati 1:1:1 e diluiti in PBTG, 1:40
anti-atubulina per topi	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	AA4.3, RRID:AB_579793	diluire in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Falloidina	Sonde molecolari	Codice A22283	diluire in PBS, 1:40
anticorpo IgG anti-topo di capra, Alexa Fluor 546	Sonde molecolari	Codice: A11030	diluito in PBTG, 1:400
Ceppi di mosche
sd-Gal4	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	#8609	ricombinato con UAS-EGFP
upd-Gal4	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	#26796	ricombinato con UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Centro RNAi di Drosophila di Vienna	#51247
UAS-scrib-RNAi	Centro RNAi di Drosophila di Vienna	#105412
UAS-RasV12	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	#64196
UAS-Yki3SA	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	#28817
hsFLP	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	#6
Act>CD2>GAL4 (GAL4 estraibile)	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	#4780	ricombinato con UAS-EGFP
UAS-EGFP	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	#5428	Cromosoma X
UAS-EGFP	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	#6658	terzo cromosoma
UAS-Dicer2	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	#24650	secondo cromosoma
UAS-Dicer2	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	#24651	terzo cromosoma
vkg-GFP	Morin et al. 2001		Trappola per proteine GFP