Questo protocollo è un estratto da Immarigeon et al., Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili di Drosophila, J. Vis. Exp. (2019).
1. Soluzioni e preparazione dei materiali
- Prepara le seguenti soluzioni.
- Prepare Serum Supplemented Medium (SSM): il terreno Drosophila di Schneider è completato con il 10% di siero fetale bovino inattivato a caldo e l'1% di penicillina-streptomicina.
- Preparare aliquote di 1x enzima tripsina (ad es. TrypLE Express Enzyme) e conservare a temperatura ambiente.
- Preparare aliquote di papaina [50 U/mL] (conservate a -20 °C e scongelate una sola volta).
- Preparare 1x tampone fosfato soluzione salina (PBS, conservato a temperatura ambiente).
- Preparare più puntali per pipette arrotondati a fiamma per la dissociazione fisica delle ghiandole accessorie.
NOTA: Utilizzare punte a bassa ritenzione per maneggiare i pressacavi accessori poiché tendono ad aderire alla plastica non trattata. Il processo di arrotondamento a fiamma riduce l'apertura della punta e leviga i bordi della punta. Ciò garantisce un'efficiente dissociazione dopo la digestione della peptidasi senza tranciare le membrane cellulari.
- Tagliare una punta da 200 μl con una lama affilata e passarla delicatamente su una fiamma per arrotondarne la punta in modo che l'apertura sia più ampia ma liscia per la manipolazione durante il passaggio 2.7.
- Restringere l'apertura di più puntali da 1.000 μl facendo passare l'apertura del puntale vicino a una fiamma per meno di un secondo. Ruotare leggermente la punta per evitare che si sciolga eccessivamente o si ostruisca. Ordina le punte da più strette a più larghe. Questo può essere fatto cronometrando la velocità di aspirazione. Provate a dissociare un campione su piccola scala di AG per testare l'efficienza delle punte più strette.
NOTA: Queste punte sono fondamentali per l'agitazione meccanica. I puntali per pipette arrotondati a fiamma di qualità consentono una dissociazione completa preservando la vitalità cellulare. Pertanto, queste punte vengono lavate accuratamente con acqua alla fine della procedura per il riutilizzo. Ciò consente una dissociazione riproducibile giorno per giorno.
2. Dissezione delle ghiandole accessorie
- Metti da 20 a 25 maschi di Drosophila in un piatto di vetro con ghiaccio.
- Seziona 1 maschio in SSM. Togliete il suo tratto riproduttivo e liberate la coppia di ghiandole accessorie da tutti gli altri tessuti a parte il dotto eiaculatorio.
NOTA: Rimuovere i testicoli perché gli spermatozoi rilasciati possono creare grumi e disturbare il processo di dissociazione. Rimuovere il bulbo eiaculatorio, che rende difficile la manipolazione quando galleggia.
- Con una pinza, trasferire i pressacavi accessori su una lastra di vetro riempita con SSM a temperatura ambiente. Ripetere i passaggi 2.2-2.3 20 volte per ottenere un lotto di 20 paia di ghiandole in SSM.
NOTA: Questi passaggi saranno raggiunti in 15-20 minuti. Gli AG dovrebbero apparire sani e i movimenti peristaltici dello strato muscolare attorno alle ghiandole dovrebbero essere visibili. La GFP può essere monitorata utilizzando un microscopio a fluorescenza.
- Trasferire i pressacavi accessori su 1x PBS per un lavaggio di 1-2 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Per una migliore dissociazione, è imperativo sciacquare le ghiandole con PBS. La durata di questo passaggio, tuttavia, dovrebbe essere limitata poiché le cellule mostrano segni di stress nella PBS; le cellule secondarie dissociate nella PBS si gonfiano rapidamente e muoiono.
- Diluire 20 μL di papaina [50 U/mL] in 180 μL di 1x enzima tripsina per ottenere la soluzione di dissociazione (per aumentare o diminuire mantenere 9 μL di enzima tripsina e 1 μL di papaina per ogni maschio). Con una pinza, trasferire i pressacavi accessori in questa soluzione.
- Isolare la punta delle ghiandole accessorie (contenenti cellule secondarie) dalla parte prossimale. Utilizzare una pinza sottile per pizzicare saldamente il centro di un lobo ghiandolare e tagliare con la punta affilata di una seconda pinza. Rimuovere la parte prossimale delle ghiandole accessorie e il dotto eiaculatorio per migliorare la dissociazione e ridurre il tempo di smistamento cellulare.
NOTA: La dissezione della parte distale da 20 paia di ghiandole richiederà dai 15 ai 20 minuti e la digestione da parte delle peptidasi inizierà quindi a temperatura ambiente.
- Dopo che tutti i puntali delle ghiandole sono stati sezionati, trasferirli in una provetta da 1,5 ml utilizzando uno speciale puntale per pipetta da 200 μl preparato al passaggio 1.2.1. Dovrebbe essere largo, arrotondato e bagnato prima di maneggiare i ghiandola.
NOTA: Per pipettare il tessuto ghiandolare accessorio, i puntali devono essere sempre pre-bagnati con una soluzione appropriata (enzima tripsina o SSM, conservare un tubo di ciascuno per questo scopo). Sciacquare accuratamente i puntali tra i campioni per evitare contaminazioni.