Drosophila melanogaster Dissezione ovarica: una tecnica per la preparazione dei tessuti ex vivo

In questo articolo

Abstract

Fonte: Parker, D. J., et al. Studio della struttura e della funzione mitocondriale nelle ovaie di Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video descrive l'anatomia generale dell'ovaio di Drosophila e presenta un metodo di dissezione delle ovaie per l'imaging dal vivo o fisso.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Parker et al., Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparazione di Drosophila (gli strumenti necessari sono illustrati in Figura 1A)

Per uno qualsiasi degli esperimenti descritti, raccogliere la Drosophila (mantenuta a temperatura ambiente, o 25 °C) entro 5 giorni dall'eclosione e metterla in una fiala riempita con 5 - 7 ml di cibo per Drosophila (vedi Tabella dei materiali), con non più di 25 mosche in ogni fiala; mantenere un rapporto femmina/maschio di 2:1.
Cospargere una piccola quantità di lievito granulato per stimolare la produzione di uova di Drosophila. Eseguire la manipolazione sperimentale entro 2-4 giorni.

2. Dissezione delle ovaie di Drosophila (gli strumenti necessari sono illustrati in Figura 1A)

Riscaldare il terreno di dissezione per insetti (vedere la Tabella dei materiali) a temperatura ambiente, 25 °C. Riempire tre pozzetti di una capsula di dissezione in vetro a otto pozzetti, con 200 μL di terreno in ciascun pozzetto.
Anestetizzare la Drosophila con CO₂ posizionando l'ago della pistola ad aria compressa sotto il tappo della fiala. Posizionali su un cuscinetto volante. Usando un microscopio da dissezione, separa 5 femmine e mettile nel primo pozzetto del piatto da dissezione. Maneggiare una Drosophila alla volta quando si esegue la microscopia dal vivo.
Mentre guardi attraverso l'oculare del microscopio da dissezione, recidi il torace dall'addome usando due paia di pinze. Usando la pinza, trasferisci con cura l'addome nel secondo pozzetto del piatto.
Usa un paio di pinze per tenere l'addome all'estremità posteriore e spingi lentamente le ovaie verso l'esterno (insieme agli altri contenuti addominali) con l'altro paio di pinze. Se questo tentativo fallisce, rimuovere con cautela l'esoscheletro addominale inserendo la pinza nell'estremità anteriore per rilasciare le ovaie.
Usando la pinza, tenere una singola ovaia per l'estremità posteriore opaca (cioè le uova piene di tuorlo in fase avanzata) e spostarla con cautela nel terzo pozzetto del piatto per stuzzicarla per elaborarla per la microscopia dal vivo o per fissarla per eseguire l'immunocolorazione.
Stuzzica con cura la guaina protettiva intorno alle ovaie facendo scorrere leggermente un ago stuzzicante dall'estremità posteriore a quella anteriore di ciascuna ovaia tenendola per l'estremità posteriore con un paio di pinze.
NOTA: Per ridurre al minimo i danni durante l'assasinatura, piegare la punta dell'ago e ingrandire ciascuna ovaia aumentando l'ingrandimento del microscopio (Figura 1A). La presa in giro dovrebbe essere abbastanza efficace da rompere la guaina, ma dovrebbe anche essere fatta con attenzione per preservare l'integrità delle ovariole.

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Risultati

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Figura 1: Piano sperimentale e preparazione. (A) Strumenti utilizzati nei metodi descritti: A. Fiala antimosche; B. Mezzo di dissezione per insetti; C. Paraformaldeide; D. Spazzola per mosche; E. Piatto di dissezione; F. Vetro di copertura; G. Tubo microfuge. H. Piatto con fondo di vetro; I. Vetrino; J. Micropipetta da 1.000 μl; K. Micropipetta da 200 μL; L. Micropipetta da 2,5 μL; M. Ag...