Dissezione del tubulo di Malpighian da una mosca adulta: isolamento di un organo osmoregolatore ed escretore

Abstract

Fonte: Rossano, A. J. e Romero, M. F. Quantificazione ottica del pH intracellulare negli epiteli del tubulo Malpighiano di Drosophila melanogaster con un indicatore di pH fluorescente codificato geneticamente. J. Vis. Exp. (2017).

Questo articolo descrive la dissezione dei tubuli Malpighian anteriori (MT) da una femmina di mosca Drosophila e un esempio di protocollo da Rossano et al. (2017) in cui le MT vengono preparate per l'imaging dal vivo in una camera di perfusione.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Rossano e Romero, Quantificazione ottica del pH intracellulare negli epiteli dei tubuli di Malpighian in Drosophila melanogaster con un indicatore di pH codificato geneticamente fluorescente, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparazione dei vetrini di poli-L-lisina

1. Disegnare un bordo di 40 x 20 mm con una penna PAP idrofoba intorno alla parte superiore dei vetrini standard da 75 x 25 mm e lasciare da parte ad asciugare per 15 minuti a RT. Utilizzare vetrini coprioggetti di grandi dimensioni se i vetrini non sono compatibili con l'ottica di imaging.
2. Trasferire 2 mL di soluzione madre di poli-L-lisina (PLL) allo 0,01% su ciascun vetrino e mettere da parte per 1 ora a RT.
3. Rimuovere il PLL in eccesso con una pipetta. Conservare la soluzione in un flaconcino da 50 mL per un uso futuro. Conservare a 4 °C.
4. Aspirare l'eventuale soluzione rimanente con una linea del vuoto. Far scorrere la linea del vuoto su tutta la superficie del vetrino per assicurarsi che non rimanga soluzione sui vetrini.
5. Mettere da parte i vetrini per 1 ora aggiuntiva a RT prima dell'uso. Conservare le diapositive asciutte a RT per un massimo di 1 mese in un album di diapositive standard.

2. Preparazione del piatto di dissezione e delle bacchette di vetro

1. Aggiungere 0,5 mL di agente indurente elastomerico a 4,5 mL di base elastomerica in una piastra Petri in polistirene da 35 x 10 mm a RT per ottenere una profondità di 5 mm. Mescolare con un puntale per pipetta monouso. Lasciare che l'elastomero polimerizzi O/N a RT.
   NOTA: L'elastomero deve essere limpido e privo di bolle. L'eliminazione delle bolle può essere facilitata mantenendo le piastre in elastomero in un barattolo sottovuoto per 10 - 15 minuti dopo il versamento.
2. Tenere tra le mani un'asta di vetro di 5 mm di diametro e fondere il centro dell'asta su un bruciatore Bunsen acceso mentre si separano le estremità. Man mano che il vetro si scioglie, tirare più rapidamente per produrre un albero sottile (0,1 mm) e affusolato (Figura 1).
   NOTA: Un angolo di 45 ° sul gambo è spesso utile nella manipolazione dei tubuli. Ciò può essere ottenuto abbassando una mano mentre il gambo viene tirato (vedi Figura 1).
3. Rompi l'asta sottile al centro con il lato smussato di una lama di rasoio in acciaio al carbonio a taglio singolo. Ispezionare l'estremità sottile dell'asta sotto un cannocchiale da dissezione per assicurarsi che la rottura sia pulita.

3. Dissezione dei tubuli Malpighian anteriori di Drosophila adulta

1. Raccogliere il piatto di dissezione e l'asta di vetro estratta dalla sezione 2, un vetrino rivestito in PLL dalla sezione 1, un divisore adesivo per pozzetti di perfusione, grasso per vuoto, una striscia di pellicola sigillante da 4 x 2", 2 paia di pinze fini #5 e aliquote da 40 ml di terreno Schneider ghiacciato e iPBS RT
.
2. Stendere il grasso sottovuoto sul nastro sigillante e premere il divisore del pozzetto di perfusione adesivo sul nastro per ricoprire il fondo di grasso. Staccare il divisore del pozzetto di perfusione adesivo e posizionarlo con il lato grasso rivolto verso il basso sopra un vetrino rivestito di PLL. Rimuovere il divisore del pozzetto di perfusione per lasciare i singoli pozzetti del campione tracciati nel grasso idrofobo.
3. Posizionare 200 μl di RT iPBS nel pozzetto cerchiato di grasso sul vetrino rivestito di PLL e spostare il vetrino sotto lo stereoscopio.
4. Mettere le mosche UAS-pHerry/capaR-GAL4 in una fiala vuota e anestetizzarle sul ghiaccio per 10 min.
   NOTA: Questo metodo di anestesia, a differenza della CO₂, assicura che le mosche non si disidratino.
5. Versare il mezzo di Schneider ghiacciato nel piatto di dissezione e utilizzare una pinza fine per trasferire una singola mosca femminile anestetizzata nel piatto sotto uno stereoscopio da dissezione.
6. Tieni la mosca per il torace con una serie di pinze e usa l'altra per afferrare delicatamente la parte posteriore dell'addome. Aprire la parte posteriore della mosca usando il forcipe con movimenti brevi e deliberati. Una volta che l'intestino posteriore è visibile, afferra l'estremità distale e libera l'intestino e le MT dalle tracheole sottostanti allontanando l'intestino posteriore dal corpo attraverso brevi e ripetuti strattoni.
   NOTA: I MT anteriori e posteriori saranno visibili nel punto in cui incontrano la giunzione dell'intestino medio e dell'intestino posteriore attraverso l'uretere. La prima coppia di MT ad essere libera saranno probabilmente i tubuli posteriori che circondano l'intestino posteriore. Questi possono essere ignorati (Figura 2A).
7. Pizzicare le MT anteriori all'uretere con una pinza fine una volta che la seconda serie di MT è libera dall'addome. Questo separerà i MT anteriori dall'intestino e chiuderà l'uretere.
8. Raccogliere i MT anteriori liberi con l'asta di vetro tirata facendo scorrere l'asta sotto l'uretere in modo che i tubuli cadano su entrambi i lati. Sollevare le MT dalla soluzione.
9. Ruotare l'asta di vetro in modo che gli MT e l'uretere aderiscano alla parte inferiore dell'asta e abbassare l'uretere verso il basso sul vetrino. Fissare l'uretere e sigillare le estremità distali dei MT premendo l'uretere verso il basso sul vetrino (Figura 2B). Non manipolare le MT più del necessario. I MT dovrebbero galleggiare nella soluzione con l'uretere ancorato al vetrino.
10. Usa l'estremità sottile dell'asta di vetro per spazzare delicatamente ogni tubulo sulla superficie del vetrino. Sostenere l'asta contro il vetrino per evitare di schiacciare il tubulo e far scorrere l'asta sopra la parte superiore del tubulo, spostandola da distale a prossimale, per fissare l'intera lunghezza di ciascun tubulo alla superficie del vetrino rivestito di PLL (Figura 2C).
11. Riposizionare il divisore adesivo del pozzetto di perfusione sul vetrino per formare un piccolo pozzetto pieno di liquido sopra il tubulo montato.
12. Posizionare il campione sul tavolino del microscopio. Posizionare i capillari di afflusso e di uscita rispettivamente sull'apertura di ingresso e di uscita del pozzetto di perfusione.
    NOTA: Il divisore del pozzetto può essere lasciato fuori se si desidera una camera di perfusione aperta. In questo caso, i capillari di afflusso e di uscita possono essere allineati ai lati opposti di un pozzetto di imaging.

Risultati

Figura 1: Fabbricazione di barre di vetro per la manipolazione di tubuli malpighiani.
A - E. Processo di riscaldamento e trazione di un'asta di vetro per produrre una conicità e un angolo adatti alla manipolazione...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di poli-L-lisina (PLL)	Sigma-Aldrich	P4832	Conservare a 4 °C, può essere riutilizzato.
Coperchi adesivi per camere di perfusione, misura adesiva 1 mm, diametro × camera 9 mm × 0,9 mm, diametro porte 1,5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Può essere sostituito secondo necessità per adattarsi al sistema di perfusione.
Kit elastomero siliconico Sylgard 184	Adesivi Ellsworth	184 KIT SIL ELAST 0,5KG	Disponibile da più fornitori.
Helping Hands Supporti per saldatura	Strumenti per il trasporto portuale	Codice 60501	Disponibile da più fornitori.
Il mezzo di Schneider	Fisher Scientifico	21720024	Conservare a 4 °C in aliquote sterili.
#5 Pinze in acciaio inox	Strumenti per la scienza	Codice 11252-20	Può essere sostituito in base al comfort dello sperimentatore.
Piastra Petri in polistirolo 35 x 10 mm	Corning Scienze della Vita	Fisher Scientific 08-757-100A	La marca e le dimensioni esatte non sono importanti.
Vetrini per microscopio 75 x 25 mm	Corning Scienze della Vita	2949-75X25	La marca e le dimensioni esatte possono variare purché i pozzetti di perfusione siano compatibili.
Vetro capillare borosilicato filimentato, diametro interno 1,5 mm, diametro esterno 0,86 mm, spessore 0,32 mm	Strumenti Warner	64-0796	Non è necessario il filo, il vetro può essere sostituito per abbinare i tubi di perfusione e i pozzetti di perfusione.
Grasso siliconico sottovuoto	Sigma-Aldrich	Z273554	Disponibile da più fornitori.
Canne di vetro, diametro 5 mm	delphiglass.com	Codice 9198	La dimensione esatta è una preferenza personale, più fornitori disponibili
Penna idrofobica PAP	Sigma-Aldrich	Z377821	Disponibile da più fornitori.
Pellicola sigillante	Sigma-Aldrich	P7668	Disponibile da più fornitori.
Provetta Falcon da 15 mL	Falco BD	352096	Disponibile da più fornitori.
Provetta Falcon da 50 mL	Falco BD	Codice 352070	Disponibile da più fornitori.
Stereoscopio di dissezione	Zeiss	Scoperta.V8	È possibile utilizzare qualsiasi stereoscopio da dissezione.
UAS-pHerry transgenico Drosophila melagnogaster	Disponibile da Romero Lab		Prima pubblicazione: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 linea di trasmissione Drosophila melagnogaster	Disponibile da Romero Lab		Prima pubblicazione: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 linea di trasmissione Drosophila melagnogaster	Disponibile da Romero Lab		Prima pubblicazione: Sozen et al., 1997
Lama di rasoio in acciaio al carbonio a taglio singolo	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 71960	Disponibile da più fornitori.
Cartella per vetrini per microscopia	Fisher Scientifico	16-04	Disponibile da più fornitori.
Bruciatore Bunsen	Fisher Scientifico	50-110-1231	Disponibile da più fornitori.
Polistrene Drosophila fiale di allevamento con flugs	Genesee Scientifico	32-109BF	Elementi comparabili possono essere sostituiti.
Secchiello per ghiaccio da laboratorio da 2,5 L	Fisher Scientifico	07-210-129	Disponibile da più fornitori.
Puntali per pipette barriera da 200 uL	MidSci	AV200	Disponibile da più fornitori.
Pipetta a volume variabile da 200 μl	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Disponibile da più fornitori.