Questo protocollo è un estratto da Eidhof et al., Analisi ad alto rendimento del comportamento locomotorio nel saggio dell'isola di Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).
1. Costruzione della scatola di analisi dell'isola
- Preparare un vassoio realizzato con un materiale robusto, come il polimetilmetacrilato (PMMA), per contenere uno strato d'acqua (ad esempio un bagno). Assicurarsi che il materiale non sia bianco.
NOTA: Si consigliano dimensioni di 40 x 35 x 2,5 cm3 (Figura 1A).
- Preparare una scatola (42 x 38 x 25 cm3) realizzata in un materiale robusto e trasparente, come il PMMA, da posizionare intorno alla vasca per evitare che le mosche fuoriescano nello spazio del laboratorio. Posizionare un foro (20 x 30 cm2) sul lato laterale che sia abbastanza grande da consentire allo sperimentatore di maneggiare facilmente le fiale con le mosche e lasciarle cadere sull'isola (Figura 1A).
- Preparare una piattaforma rialzata di 10 x 15 x 2,5 cmdi dimensioni 3, realizzata in materiale impermeabile (PMMA o plastica) a tenuta stagna.
NOTA: Questa piattaforma deve avere una superficie bianca uniforme per garantire un buon contrasto per l'analisi delle immagini. La dimensione non è necessariamente fissa, ma dovrebbe essere abbastanza grande da garantire che tutte le mosche inizialmente atterrino sulla piattaforma e abbiano la possibilità di camminarci sopra (Figura 1A).
- Fissa la piattaforma incollandola alla vasca da bagno o posizionando pesi o altri oggetti pesanti all'interno della scatola della piattaforma per evitare cambiamenti di posizione della piattaforma durante la sessione sperimentale/di ripresa.
2. Requisiti del software e installazione
- Installazione di un software di registrazione delle immagini.
- Scarica il software di registrazione delle immagini per registrare la serie di immagini dell'isola (vedi la Tabella dei materiali) e installa il software su un computer.
NOTA: Il software di registrazione delle immagini descritto in questo protocollo è supportato solo da Windows. Un'alternativa per gli altri utenti è stata aggiunta alla Tabella dei Materiali.
3. Preparazione delle mosche da testare nel saggio dell'isola
- Raccogliere mosche in stadi per ogni condizione sperimentale in anestesia fredda o con anidride carbonica (CO2), come descritto in precedenza (per un periodo di 1 - 2 giorni).
- Preparare un minimo di 3 fiale di campioni per condizione sperimentale, ciascuna contenente circa 15 mosche in stadi. Utilizzare solo mosche con ali intatte e di età e sesso simili.
NOTA: Per gli esperimenti qui descritti, 5 fiale campione contenenti 15 moscerini maschi dei genotipi w-; Actin-Gal4/+ (controllo) e w-; L'actina-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) è stata raccolta il giorno dell'eclosione, invecchiata per 4 giorni, ed è stata utilizzata per eseguire il test dell'isola. L'RNAi, i ceppi di controllo e il driver Actin-gal4 sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi la Tabella dei materiali).
- Lascia che le mosche si riprendano per evitare gli effetti degli anestetici (almeno 1 giorno quando usi CO2) prima di testare le mosche raccolte nel test dell'isola all'età di interesse.
4. Configurazione sperimentale
NOTA: Vedi Figura 1B.
- Aggiungere acqua fredda con una piccola quantità di sapone al vassoio da bagno e posizionare la piattaforma al centro.
NOTA: Il sapone diminuisce la tensione superficiale dell'acqua; Le mosche che toccano l'acqua annegheranno. Ciò impedisce l'aumento della quantità di mosche che volano nella scatola durante la progressione della sessione sperimentale.
- Posiziona la scatola trasparente sopra il vassoio e illumina la piattaforma dall'alto usando una lampada.
NOTA: L'illuminazione della piattaforma è necessaria principalmente per garantire un corretto contrasto video. A questo scopo è adatta una normale luce LED da 12 V.
- Posiziona la webcam direttamente sopra la piattaforma (fuori dalla scatola) e collegala a un computer.
- Crea nuove cartelle sul computer per memorizzare i diversi dati sperimentali prima degli esperimenti.
- Segui la struttura dell'esempio illustrato in Figura 2A per creare le cartelle. Ad esempio, se il disegno sperimentale richiede il test di due genotipi con cinque repliche ciascuno, creare prima una cartella principale contenente la data dell'esperimento. All'interno della cartella principale, crea due sottocartelle (una per genotipo). All'interno delle cartelle del genotipo, crea cinque nuove sottocartelle, una per replicate.
NOTA: Per ulteriori analisi, è essenziale che le serie di immagini corrispondenti ai singoli esperimenti siano salvate in cartelle con nomi univoci.
5. Impostazioni video Impostazione nella sezione "Dispositivo di acquisizione" dell'interfaccia
- Aprire il software di registrazione delle immagini e, nella scheda "Acquisizione", fare clic su "Immagini time-lapse..." e selezionare la webcam appropriata come "Dispositivo di acquisizione".
- Posiziona una mosca morta sull'isola; regola le impostazioni video facendo clic sulla casella "Impostazioni video". Scorri le barre degli strumenti, regolando la luminosità, il contrasto e il colore in modo tale che la mosca morta appaia nera su uno sfondo bianco (Figura 2B). Al termine delle regolazioni, fare clic su "Ok".
6. Impostazioni di registrazione e salvataggio video Impostazione nella sezione "Time-lapse" dell'interfaccia
- Regola le impostazioni in "Time-Lapse Movie Setup" per salvare l'esperimento come file .avi. Clicca su "Sfoglia...", seleziona la directory in cui verrà memorizzato il filmato, definisci il nome del video e premi "salva".
NOTA: Il file video non viene utilizzato per la quantificazione dei dati; Tuttavia, potrebbe essere utile avere un'idea generale dell'esperimento.
- Regolare le impostazioni nella sezione "Impostazione filmato time-lapse".
- Nella casella di compressione, seleziona "Codice Intel IYUV" per la compressione video e scegli "Scatta un fotogramma ogni 0,1 secondi", con la "Velocità di riproduzione (immagini al secondo):" a 10.
- Salva le serie temporali dell'esperimento come fotogrammi .bmp facendo clic su "Avanzate..." Seleziona "Crea un'immagine .bmp per ogni fotogramma acquisito". Fare clic su "Sfoglia". Selezionare la stessa directory nella finestra "Durante l'acquisizione di filmati AVI" (come scelto nel passaggio 6.1), fare clic su "Apri" e premere "Ok".
NOTA: Si noti che, durante l'esperimento, i fotogrammi vengono memorizzati come file .bmp (necessari per l'analisi dei dati). Il programma nomina i fotogrammi come "A" seguito dal numero corrispondente alla sequenza di acquisizione dei fotogrammi (ad esempio, "A_number.bmp") (Figura 2C). Salvare sempre le immagini appartenenti a diversi esperimenti in una nuova cartella per garantire che le serie di immagini registrate in precedenza non vengano sovrascritte. Tenere presente che le immagini non vengono salvate automaticamente nella stessa cartella del file video, a meno che questa cartella non sia selezionata in "Sfoglia..." dopo aver fatto clic sulla casella "Avanzate".
7. Analisi dell'isola e raccolta dati
- Premere il pulsante di avvio nell'interfaccia dell'immagine time-lapse del software di registrazione delle immagini per avviare la registrazione.
- Picchiettare la fiala sperimentale contenente le mosche (passaggio 3) 2-3 volte per assicurarsi che le mosche siano sul fondo della fiala. Rimuovere rapidamente il tappo della fiala e, con un movimento vigoroso, picchiettare la fiala sulla piattaforma in modo che tutte le mosche cadano contemporaneamente sulla piattaforma (Figura 1C).
- Dopo circa 30 s, premere il pulsante "Stop" per interrompere la registrazione.
NOTA: Se tutte le mosche scompaiono dalla piattaforma, la registrazione può essere interrotta prima.
- Rimuovere manualmente le mosche che rimangono per 30 s sulla piattaforma dopo aver interrotto la registrazione dell'immagine.
- Prima di procedere alla registrazione dell'esperimento successivo, modificare la directory di destinazione per i file .bmp e i filmati (vedere la sezione 6).
