Questo protocollo è un estratto da Bovier et al., Metodi per testare l'interferenza endocrina in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).
1. Preparazione del cibo
- Per il mantenimento delle scorte e per la crescita delle larve, utilizzare un terreno di farina di mais contenente il 3% di lievito in polvere, il 10% di saccarosio, il 9% di farina di mais precotta, lo 0,4% di agar, da allora in poi chiamato terreno di farina di mais (CM).
- Mettere 30 g di lievito in 100 ml di acqua di rubinetto, portare a ebollizione e lasciare bollire per 15 min.
- A parte, mescolare bene 90 g di farina di mais precotta, 100 g di zucchero e 4 g di agar agar in 900 ml di acqua del rubinetto.
- Portate la soluzione a bollore, abbassate la fiamma e cuocete per 5 minuti mescolando continuamente.
- Dopo 5 minuti, aggiungere la soluzione di lievito caldo e cuocere a fuoco lento per altri 15 minuti.
- Spegnere la fonte di calore e lasciare raffreddare la soluzione a circa 60 °C.
- Aggiungere 5 mL/L di metil-4-idrossibenzoato al 10% in etanolo, mescolare accuratamente e lasciare riposare per 10 min.
NOTA: Attenzione alla quantità di metil4-idrossibenzoato, dato che un'alta concentrazione di fungicida potrebbe essere letale per le larve.
- Erogare il terreno in fiale/flaconi: 8 ml in ogni fiala (25 mm x 95 mm), 3 ml in ogni fiala (22 mm x 63 mm) e 60 ml in ogni flacone (250 ml).
- Coprire le fiale con una garza e lasciarle asciugare a temperatura ambiente (RT) per 24 ore prima di riporle.
- Calibrare sperimentalmente la corretta consistenza e idratazione del CM modificando la quantità di agar utilizzato e/o i tempi di raffreddamento/essiccazione.
NOTA: le fiale scollegate, inscatolate e avvolte sono stabili per circa 15 giorni a 4 °C.
- Per gli adulti di Drosophila, utilizzare un terreno contenente il 10% di lievito in polvere, il 10% di saccarosio, il 2% di agar, da qui in poi chiamato terreno adulto (AM).
- Mescolare 10 g di lievito in polvere, 10 g di saccarosio, 2 g di agar agar in 100 ml di acqua distillata.
- Portare a ebollizione la miscela due volte, con un intervallo di 3 minuti, o fino a quando l'agar non si sarà sciolto, utilizzando un forno a microonde.
- Una volta che la soluzione si è raffreddata a 60 °C, aggiungere 5 mL/L di metil-4-idrossibenzoato al 10% in etanolo, mescolare accuratamente e dosare in flaconcini (10 mL per flaconcino).
- Coprire le fiale con una garza e lasciarle asciugare a RT per 24 ore prima di riporle.
NOTA: le fiale scollegate, inscatolate e avvolte sono stabili per circa 15 giorni a 4 °C.
2. Dosaggio EDC di Drosophila
- Preparare una soluzione madre appropriata sciogliendo l'EDC selezionato nel solvente adatto. Per l'EE2 (peso molecolare 296,403), sciogliere 1,48 g in 10 mL di etanolo al 100% per ottenere una soluzione madre 0,5 M e conservare a -80 °C.
cautela: Gli EDC sono considerati inquinanti ambientali e devono essere prese precauzioni nel loro trattamento.
- Diluire la soluzione madre di EE2 in etanolo al 10% in acqua (v/v) per ottenere una soluzione da 100 mM. Effettuare le diluizioni successive (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM) negli alimenti CM, iniziando con la concentrazione più bassa e utilizzando la stessa concentrazione finale di solvente per ciascun gruppo di trattamento. Per le fiale di controllo utilizzare lo stesso volume del solo solvente.
NOTA: si raccomanda di mantenere la concentrazione finale del solvente il più bassa possibile, tenendo presente che la concentrazione finale di etanolo non dovrebbe superare il 2% nel cibo per mosche.
- Aggiungere la soluzione contenente la giusta diluizione dell'EDC selezionato all'alimento a base di farina di mais prima della solidificazione, mescolare accuratamente con un robot da cucina, erogare 10 ml in fiale, coprire con una garza di cotone e lasciare asciugare a RT per 16 ore prima dell'uso.
NOTA: usa questo mezzo subito dopo la sua preparazione.
- Per l'allevamento degli adulti, preparare diverse soluzioni EE2 di lavoro (10 mM, 50 mM e 100 mM, rispettivamente) in etanolo al 10% in acqua (v/v) e stendere 100 μL di ciascuna sulla superficie dell'AM, al fine di ottenere la concentrazione desiderata di EE2 (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM). Per il controllo utilizzare lo stesso volume del solo solvente.
NOTA: in alternativa, aggiungi la soluzione contenente la giusta diluizione dell'EDC selezionato a una piccola quantità di AM in una provetta conica da 50 mL, agita accuratamente e stratifica 1 mL di essa sulla superficie delle fiale AM.
- Coprire le fiale con una garza di cotone, lasciare asciugare a RT per 12-16 ore sotto leggera agitazione e utilizzarle immediatamente.
NOTA: il processo di essiccazione dovrebbe essere regolato sperimentalmente perché dipende dall'umidità ambientale.
3. Allevamento di mosche
- Utilizzare un ceppo isogenico robusto, come l'Oregon R, mantenuto da diverse generazioni in laboratorio.
- Conservare le mosche in un'incubatrice umidificata a temperatura controllata, con un fotoperiodo naturale di luce 12 ore: 12 ore di buio a 25 °C in fiale contenenti mangime CM.
- In ogni test, utilizzare le fiale a RT.
4. Protocollo di durata della vita
- Preparare 20 fiale di mosche con 8 femmine e 4 maschi e allestire a 25 °C in CM (10 ml ciascuna).
- Dopo 4 giorni scartare le mosche e rimettere le fiale nell'incubatrice.
NOTA: queste mosche possono essere utilizzate per ricominciare da capo per ottenere altre coorti di mosche sincronizzate con l'età.
- Nel tardo pomeriggio del giorno 9, rimuovere tutte le mosche appena chiuse dalle fiale e rimettere le fiale nell'incubatrice.
NOTA: alcuni adulti dovrebbero iniziare a chiudere già dal nono giorno; Scartare queste mosche permette di raccogliere un numero massimo di mosche sincronizzate, evitando la selezione incauta di quelle di emergenza precoce.
- Dopo 16-24 ore, trasferire i moscerini adulti (1 giorno di età) di entrambi i sessi in quattro gruppi di flaconi da 250 ml contenenti alimenti AM integrati con tre diverse concentrazioni di EDC e uno con il solo solvente. Se necessario, raccogli un altro lotto il giorno successivo.
- Mantenere le mosche a 25 °C per 2-3 giorni per consentire loro di accoppiarsi.
NOTA: il giorno del trasferimento alle fiale di cibo AM corrisponde al primo giorno di età adulta.
- Dopo due-tre giorni, suddividere ogni coorte di moscerini in base al sesso in due gruppi sotto leggera anestesia con CO2. Suddividere casualmente ogni sesso in cinque fiale per trattamento a una densità di 20 individui per fiala, fino a quando non ci sono tre repliche di 5 fiale parallele per ogni sesso per ogni trattamento.
NOTA: Lavora con piccoli gruppi di mosche per prevenire possibili problemi di salute di lunga durata dovuti al lungo tempo di esposizione alla CO2.
- Preparare un foglio di calcolo della durata della vita in cui il numero di mosche morte viene sottratto dal numero di mosche sopravvissute al trasferimento precedente, in modo tale da ottenere automaticamente il numero di sopravvissuti ad ogni trasferimento.
- Trasferire le mosche in nuove fiale contenenti il cibo corrispondente ogni 3 giorni contemporaneamente e controllare la morte.
NOTA: il trasferimento deve avvenire senza anestesia che potrebbe avere un effetto negativo a lungo termine sulla longevità della mosca.
- Ad ogni trasferimento, registrare l'età delle mosche e il numero di mosche morte.
NOTA: il numero di mosche sopravvissute viene calcolato automaticamente nel foglio di calcolo, ma si consiglia di controllarlo visivamente. Le mosche che accidentalmente fuggono o muoiono durante il trasferimento non dovrebbero essere considerate. Fare attenzione a non contare due volte le mosche morte portate sulla nuova fiala riportando questa nota nel foglio di calcolo.
- Ripeti i passaggi 4.8 e 4.8.1 fino a quando tutte le mosche muoiono.
- Per ogni gruppo di trattamento, creare una curva di sopravvivenza come mostrato in Figura 1, al fine di visualizzare la probabilità di sopravvivenza di una mosca in un determinato momento.
- Esegui tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo di trattamento di mosche, utilizzando 100 mosche appena chiuse per ogni esperimento.
- Preparare una tabella in cui riportare la durata media della vita (giorni medi di sopravvivenza di tutte le mosche per ogni gruppo), il tempo di metà morte (periodo di tempo in giorni necessario per raggiungere il 50% di mortalità) e la durata massima della vita (numero massimo di giorni necessari per raggiungere il 90% di mortalità).
- Calcolare le differenze in percentuale tra ciascun gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo.
- Eseguire analisi statistiche per confrontare i diversi gruppi di trattamento.
