drosofila Quantificazione della giunzione neuromuscolare (NMJ): un metodo per valutare la morfologia e la funzione sinaptica

Questo protocollo è un estratto da Castells-Nobau et al., Due algoritmi per l'alto rendimento e la quantificazione multiparametrica della morfologia della giunzione euromuscolare di Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).

1. Requisiti prima dell'elaborazione delle immagini

1. Eseguire le preparazioni a libro aperto di larve erranti di terzo stadio (L3), come descritto in precedenza.
2. Co-immunomarcare i terminali NMJ di Drosophila utilizzando una combinazione di due marcatori: Dlg-1 o Hrp insieme a Brp per l'analisi con "Drosophila NMJ Morphometrics", e Syt o Csp insieme a Brp per l'analisi con "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   NOTA: Gli anticorpi della stessa specie possono essere combinati pre-marcandone uno con un kit di coniugazione anticorpale come i kit di marcatura Zenon Alexa.
3. Immagine dei terminali NMJ utilizzando un microscopio a scelta, ad esempio la fluorescenza (con o senza ApoTome) o la microscopia confocale.
   1. Acquisisci uno stack di immagini a 2 canali del terminale NMJ.
      1. Regolare le impostazioni del microscopio in modo che il canale 1 acquisisca il terminale NMJ immunomarcato con Dlg-1 (o Hrp, Syt, Csp) e il canale 2 il terminale NMJ immunomarcato con Brp.
      2. Opzionalmente, analizzare le immagini a un canale (di sinapsi immunomarcate con un singolo anticorpo) con i macro. Immagine NMJ immunomarcati in modo univoco con Dlg-1 o Hrp per l'analisi con "Drosophila NMJ Morphometrics", o Syt o Csp per "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
         NOTA: Non è possibile analizzare sinapsi immunocolorate con solo anti-Brp.
   2. Esporta le immagini ottenute come singoli file .tiff. Invertire l'ordine dei canali prima di eseguire le macro, se non acquisite come indicato.

2. Requisiti del software e installazione

1. Scarica le macro: "Drosophila NMJ Morphometrics" e "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" dal seguente sito web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. Spostare il cursore sulla cartella "Aggiornamento macro 1" e fare clic sull'opzione "visualizza" che appare. Apparirà un elenco con il contenuto di questa cartella. La cartella contiene le macro "Drosophila NMJ Morphometrics" e "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   NOTA: Entrambe le macro sono compatibili con le versioni 1.4 delle Figi, anch'esse fornite nella stessa cartella. Le macro potrebbero non essere eseguite nelle versioni recenti. Si prega di utilizzare la versione 1.4 fornita. Non è problematico avviare questa versione, anche su computer con una versione più recente delle Figi disponibile.
3. Clicca su "Scarica tutto". Il contenuto della cartella verrà scaricato sul computer come file .zip. Decomprimi il file scaricato.
4. Copia i file Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm e Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm nella directory Fiji.app/plugins/. Al riavvio del programma, le macro appariranno nella parte inferiore del menu a discesa Plugin.

3. Esegui la sotto-macro "Converti in Stack" per creare proiezioni Z e Hyperstack delle immagini NMJ

1. Avvia l'interfaccia grafica selezionando Plugin nella barra degli strumenti e scegli "Drosophila NMJ Morphometrics" nel menu a discesa.
2. Definire l'impostazione "Stringa file univoca" nell'interfaccia grafica della macro.
   NOTA: Il software del microscopio utilizza una firma di identificazione per organizzare piani e canali durante la memorizzazione delle pile come singoli file di .tiff. L'impostazione univoca della stringa di file inserita deve specificare la firma assegnata dal software al primo piano del primo canale (importante: è necessario indicare il piano più basso e il numero del canale).
3. Seleziona solo la sotto-macro "Converti in stack" e fai clic su "ok" e seleziona la cartella in cui si trovano le immagini. Se viene selezionata una directory principale con diverse sottocartelle, verranno elaborati tutti i singoli file '.tiff all'interno della directory principale e della sottocartella che corrispondono ai criteri univoci della stringa di file.
   1. Se lo z-stack contiene un solo canale, selezionare la casella "Solo canale 1".
4. Si noti che verranno visualizzati due nuovi file per ogni immagine NMJ, definiti per impostazione predefinita come stack_image_name e flatstack_image_name. Memorizza solo questi stack e flatstack per ulteriori analisi. A questo punto, le serie di file .tiff possono essere eliminate, riducendo al minimo le capacità di archiviazione necessarie ed evitando potenziali fonti di errore.

4. Esegui la sottomacro "Definisci ROI" per Delineare il Terminale NMJ di Interesse

1. Avvia l'interfaccia grafica di "Drosophila NMJ Morphometrics".
2. Selezionare solo la casella di controllo "Definisci ROI" e premere "OK" e selezionare la directory principale in cui sono memorizzate le immagini intitolate flatstack_name e premere "Seleziona". La sottomacro "Definisci ROI" cerca automaticamente in tutte le sottocartelle all'interno della directory principale selezionata.
3. All'apertura della prima proiezione, selezionare lo strumento "Selezioni a mano libera" nella barra degli strumenti.
4. Disegnare con il mouse una selezione che contenga esclusivamente il terminale NMJ completo di interesse e fare clic su "OK" nella finestra "Definisci terminale". La macro procederà con la proiezione successiva.
5. Delinea la ROI successiva e ripeti fino a quando tutte le ROI non sono definite. Il file immagine ROI, denominato "roi_image_name", verrà archiviato nella stessa directory delle immagini di stack e proiezione precedentemente generate per ciascuna delle immagini elaborate. L'output di questa sottomacro è un'immagine binaria del ROI in bianco su sfondo nero.

5. Esegui la sottomacro "Analizza" per quantificare le caratteristiche del terminale NMJ

1. Vai alla barra degli strumenti, seleziona "Plugins" e usa:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics" quando si analizzano sinapsi immunomarcate con anti-Dlg-1 o anti-Hrp (canale 1) insieme ad anti-Brp (canale 2), o "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" quando si analizzano sinapsi immunomarcate con anti-Syt o anti-Csp (canale 1) insieme a Brp (canale 2).
   1. Quando si devono analizzare stack di immagini di un canale (il canale strutturale Dlg-1 o HRP per "Drosophila_NMJ_Morphometrics", o Syt o Csp per "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), selezionare la casella "Solo canale 1".
2. Regolare la scala corrispondente alle immagini da analizzare.
   1. Se un pixel nell'immagine corrisponde a 2,5 μm, indicare Scala-Pixel = 1, Scala-Distanza in μm = 2,5. Nel caso in cui entrambe le impostazioni vengano lasciate a 0, l'area NMJ, il perimetro, la lunghezza e la lunghezza del ramo più lungo saranno espressi in numero di pixel.
3. Se necessario, regolare le impostazioni di analisi predefinite della macro. Eseguire le regolazioni solo se la sottomacro "Analizza" è stata precedentemente eseguita con risultati insoddisfacenti (vedere la fine di questa sezione e la sezione 6 per istruzioni su come ottimizzare le impostazioni).
4. Selezionare le caselle di controllo "Analizza" e "Attendere" e premere "OK".
   1. Selezionare la casella di controllo "Attendi" quando si esegue la sottomacro "Analizza" su immagini a 2 canali. In caso contrario, possono verificarsi errori nel conteggio delle zone attive a causa delle limitate capacità del computer.
5. Quando si apre una nuova finestra "Scegli una directory", selezionare la directory in cui si trovano le immagini e premere "seleziona". La macro analizzerà tutte le immagini memorizzate nella directory principale e, se applicabile, nelle cartelle successive (utilizzando i tre file dell'esecuzione delle sottomacro precedenti: stack_image_name, flatstack_image_name e roi_image_name). La macro elabora ogni immagine individualmente e consecutivamente. Questa operazione può richiedere diversi minuti per stack di immagini (a seconda della capacità del computer).
6. Dopo aver eseguito la macro, si noti che nella cartella padre verrà creato un nuovo file immagine denominato res_image_name per ogni sinapsi analizzata memorizzata. Le misurazioni quantitative saranno memorizzate come file "results.txt".
7. Ispeziona tutte le immagini dei risultati per rilevare ed escludere le immagini con errori di segmentazione. I possibili errori di segmentazione sono descritti nella Tabella 1, insieme a consigli su come regolare le impostazioni per aggirare questi errori. Le immagini dei risultati con tali errori di segmentazione sono fornite come esempi in Figura 1.
   NOTA: Quando si esegue la macro con le impostazioni predefinite osservate nell'interfaccia utente, si verifica un'accuratezza di circa il 95% quando la valutazione della macro viene confrontata con la valutazione manuale.

6. Regola le Impostazioni Macro per le Immagini

1. Quando più del 5% delle immagini mostra errori di segmentazione, esplora i diversi algoritmi per definire/scegliere le impostazioni macro più adatte per le immagini.
2. Regola il valore del raggio della sfera rotante
   NOTA: La funzione del raggio della sfera rotante sottrae lo sfondo dell'immagine. Questa funzione è di fondamentale importanza quando si lavora con immagini acquisite su microscopi a fluorescenza e/o quando le immagini hanno un elevato rumore di fondo. La sottrazione dello sfondo aiuterà i passaggi di auto-thresholding della macro a produrre un'adeguata segmentazione dei terminali NMJ.
   1. Seleziona tre immagini NMJ stack_image_name generate dalla sottomacro "Converti in stack". Scegli le immagini che sono rappresentative per il set di dati dell'immagine.
   2. Nella barra degli strumenti, seleziona Immagine | Colore | Canali divisi. Verranno create due pile di immagini, una che rappresenta rispettivamente il canale 1 e l'altra il canale 2, e le salveranno.
   3. Aprire lo stack di immagini appartenente al canale 1 aperto, corrispondente all'immunomarcatura Dlg-1, Hrp, Syt o Csp.
   4. Esegui il filtro "Sottrai sfondo" selezionando "Elabora" nella barra degli strumenti seguito da "Sottrai sfondo..." nel menu a discesa.
   5. Fare clic sulla casella di controllo di anteprima nella finestra pop-up e regolare il raggio della sfera rotante al valore più appropriato per le immagini. L'impostazione "Raggio della palla rotante" dovrebbe essere regolata su valori che aumentano il contrasto tra sinapsi e sfondo (vedi Figura 2A').
      1. Vedi Figura 2 per un esempio. Nel pannello A, parti della sinapsi mostrano gli stessi livelli di grigio dello sfondo, mentre nel pannello Figura 2 un "raggio della palla rotante" di 500 risulta in un forte contrasto tra la sinapsi e lo sfondo.
   6. Crea una proiezione z selezionando nella barra degli strumenti Immagine | Pila| Proiezione Z, scegliere Tipo di proiezione = Intensità massima e salvare l'immagine risultante. Quando viene definito il valore appropriato per il raggio della sfera che rotola, eseguire l'algoritmo "Sottrai sfondo" sulle immagini rappresentative rimanenti con lo stesso valore del raggio della sfera rotante. Crea le proiezioni Z e salvale (in qualsiasi directory).
      NOTA: Il valore del raggio della sfera di rotolamento per le immagini a 8 bit o RGB deve essere almeno pari al raggio dell'oggetto più grande nell'immagine che non fa parte dello sfondo. Per le immagini a 16 bit e a 32 bit, il raggio deve essere inversamente proporzionale all'intervallo di valori dei pixel.
3. Determinare le diverse soglie automatiche che verranno utilizzate
   1. Aprire le proiezioni Z salvate nel passaggio precedente (6.2.6) e selezionare Immagine | Regola | Soglia automatica | Prova tutto.
   2. Come immagine di risultato con soglia binaria apparirà con tutti i diversi algoritmi di soglia automatica, determinare l'algoritmo più adatto per le immagini.
      1. Quando si esegue la macro in un secondo momento, modificare di conseguenza la soglia nelle impostazioni della macro.
      2. Utilizzare soglie più restrittive come "RenyiEntrophy" o "Moments" come soglia di contorno NMJ e soglie più permissive come "Li" per determinare lo scheletro NMJ e "Huang" per determinare le zone attive. Quando le immagini sono molto nitide con poco o nessuno sfondo, usa "Huang" come soglia di contorno NMJ. In caso contrario, parti della sinapsi potrebbero mancare dopo la segmentazione dell'immagine.
      3. Vedi Figura 2B per un esempio. Un'appropriata segmentazione della sinapsi si ottiene con auto-soglie evidenziate da caselle verdi. Alcuni esempi di soglie non adatte sono evidenziati da caselle rosse (controllare le sinapsi ad alto ingrandimento). In quest'ultimo, mancano parti della sinapsi o sono incluse parti dello sfondo.
4. Determinare la dimensione massima delle piccole particelle
   NOTA: Questa funzione escluderà dall'analisi tutte le particelle rilevate dalla soglia del contorno NMJ e dalla soglia dello scheletro che sono inferiori al valore definito nell'"impostazione delle particelle piccole". Questo valore è definito in pixel. Questa funzione funge da filtro antirumore ed è molto utile quando nelle immagini ottenute sono presenti alti tassi di fondo non uniforme (come cristalli/polvere).
   1. Aprire le proiezioni Z salvate nel passaggio 6.2.6 e impostare la scala per rilevare il numero di pixel tramite Analizza | Imposta scala. Applicare le seguenti impostazioni: distanza in pixel = 1, distanza nota = 1, proporzioni pixel = 1, unità di lunghezza = pixel e premere "Ok". Fare clic sullo strumento "Selezione ovale" nella barra degli strumenti.
   2. Usando il mouse disegna una selezione che circonda strettamente le singole particelle che sono presenti nell'immunocolorazione ma non appartengono alla NMJ. Premi Ctrl+m per un utente Windows o cmd+m per gli utenti Mac. Si aprirà una finestra dei risultati, che indica l'area delle particelle selezionate in numero di pixel.
   3. Ripeti il passaggio precedente più volte con diversi artefatti presenti nelle immagini per determinare la particella contaminante più grande/area artefatto. Questo sarà il valore da impostare nell'impostazione quando si esegue la macro in un secondo momento. Durante l'esecuzione della macro, impostare la "Dimensione delle particelle piccole" come la dimensione delle particelle più piccola osservata con un margine del 25%.
   4. Vedi Figura 2D per un esempio. Il cristallo più grande rilevato ha un'area di 112 pixel. L'impostazione "Dimensione piccole particelle", quando si elabora questa immagine con la macro, deve essere impostata su 125 - 150.
5. Determinare la dimensione minima del bottone
   NOTA: Questa funzione escluderà dall'analisi tutti i bottoni rilevati dalla soglia di contorno NMJ che sono inferiori al valore definito. Questo valore è definito in pixel.
   1. Seguire gli stessi passaggi descritti nella sezione 6.4, ma in questo caso disegnare una selezione intorno ai bottoni più piccoli presenti nel terminale NMJ. Scegli l'area più piccola corrispondente al bottone più piccolo tra quelli misurati. Questo è il valore da impostare nell'impostazione della dimensione minima del pulsante quando si esegue la macro in un secondo momento.
6. Definire il valore "Massima tolleranza al rumore"
   1. Per definire il valore "Trova tolleranza massima al rumore" per la macro, aprire lo Z-stack del canale 2 salvato nella sezione 6.2.2.
   2. Vai alla scheda dei plug-in nel menu a comparsa, seleziona Elabora | Massimo (3D) e, quando viene visualizzata la maximum_image_name (che può richiedere alcuni minuti), chiudere la pila di immagini originale.
   3. Seleziona il Maximum..._image_name (la pila di immagini appena ottenuta) e seleziona Plugin | Processo | Minimo (3D), quando appare la nuova immagine Minimo di Maximum..._image_name chiudere la pila Massimo... _image_name.
   4. Nella barra degli strumenti, seleziona Elabora | Trova maxima.... Si aprirà una nuova finestra "Trova maxima...". Fare clic sulla casella di controllo "Anteprima selezione punto..." e riempire la casella "Tolleranza rumore" con l'impostazione macro predefinita 50. I punti massimi saranno indicati nell'immagine come piccole croci.
      1. Aumentare il valore di "Tolleranza rumore" se si osserva un eccesso di zone attive annotate, cioè incroci che non si trovano sopra le zone attive che non sono a fuoco sul piano di impilamento selezionato o false zone attive che vengono rilevate sullo sfondo.
         1. D'altra parte, se si osservano zone attive annotate in modo incompleto, cioè zone attive a fuoco che non vengono riconosciute, diminuire il valore di "Tolleranza massima al rumore". Continua a provare valori diversi seguendo questa procedura fino a quando le croci non etichettano correttamente le zone attive a fuoco. Riempi il valore "Trova tolleranza massima al rumore" con questo valore.
         2. Vedi Figura 2C per un esempio. Sono state rilevate troppe zone attive. In Figura 2C' vengono rilevate solo le zone attive a fuoco quando si aumenta il valore di "Massima tolleranza al rumore".
   5. Eseguire la sotto-macro "Analizza" per le immagini rappresentative selezionate nel passaggio 5.1, con le impostazioni definite in tutti i passaggi precedenti.
7. Regola la soglia inferiore e superiore del Brp-puncta
   1. Si noti che dopo l'esecuzione della macro verrà visualizzato un nuovo file in base al passaggio 6.6, denominato 2_active_zone_stack_image_name. In questa pila di immagini, le zone attive rilevate dalla funzione "Trova massimi" sono indicate da punti bianchi su ciascun piano.
   2. Apri questo file trascinandolo nella barra degli strumenti e seleziona Immagine | Pila | Progetto Z | Tipo di proiezione = Somma sezioni. Si otterrà una proiezione del 2_active_zone_stack_image_name.
   3. Seleziona immagine | Regola | Soglia. Si aprirà una nuova finestra "Soglia". Far scorrere la barra superiore per scegliere un valore di soglia in cui tutti i focolai/punti positivi Brp desiderati vengono visualizzati in rosso.
      NOTA: Se la soglia è impostata su un valore troppo basso, verrà conteggiato un eccesso di zone attive. Se impostato su un valore troppo alto, una frazione delle zone attive andrà persa.
      1. Vedi Figura 2E per un esempio. Quando la soglia è impostata su 400, la maggior parte delle zone attive (simboleggiate come fuochi da 1 pixel) non sono incluse nella segmentazione, poiché non sono evidenziate in rosso (Figura 2E). Quando la soglia è impostata su un valore di 50, tutte le zone attive sono evidenziate in rosso (Figura 2E').
   4. Definire questo valore come soglia minima. Lasciare "Soglia punti superiore" sul valore massimo.
   5. Eseguire nuovamente la sottomacro "Analizza" per le immagini rappresentative con le impostazioni definite in tutti i passaggi precedenti di questa sezione. Valuta criticamente i file immagine risultanti e assicurati che la segmentazione venga eseguita correttamente. In caso contrario, regolare nuovamente le impostazioni in base alla natura degli errori di segmentazione (Figura 1, Tabella 1).

Figura 1: Esempi di risultati di segmentazione macro inappropriati. Immagini dei risultati dopo l'esecuzione di "Drosophila NMJ Morphometrics" o "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Parti del terminale sinaptico non sono incluse nel contorno giallo (A). Parti dello sfondo sono incluse nel terminale sinaptico dal contorno giallo (B). La linea blu dello scheletro si estende oltre il terminale sinaptico (C - D). Sono state rilevate troppe zone attive (E - E'). Alcune zone attive non vengono rilevate dall'analisi (G - G'). Le zone attive vengono rilevate al di fuori della sinapsi (F). Segmentazione dei bottoni errata (applicabile solo quando si esegue Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), i bottoni vengono persi (H) o troppi bottoni vengono rilevati dalla segmentazione (I). Le particelle come cristalli o polvere che fanno parte dello sfondo sono incluse nella segmentazione (J). Le informazioni su come modificare le impostazioni per evitare questi errori sono fornite nella Tabella 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempi di regolazioni delle impostazioni macro e le loro conseguenze per la segmentazione delle immagini. (A) Sottrarre l'anteprima di fondo di una sinapsi immunomarcata Dlg-1, ripresa su un microscopio a fluorescenza con ApoTome, quando il "raggio della sfera rotante" è impostato su 20 (A) o 500 (A'). (B) Immagini di output ottenute dopo l'esecuzione di Immagine | Regola | Soglia automatica | Prova tutte le immagini illustra le segmentazioni delle immagini ottenute dai 16 diversi algoritmi di auto-soglia. (C) anteprima "Trova Maxima" quando si imposta "Tolleranza rumore" a 50 (C) e 500 (C'); Le zone attive rilevate dalla segmentazione sono contrassegnate da una piccola croce. (D) Misurazione delle "piccole particelle" che appaiono sullo sfondo dell'immagine di una sinapsi immunomarcata con anti-Hrp, riprodotta su un microscopio confocale. (E) Proiezione "Sum slices" ottenuta dal 2_active_zone_stack_ima-ge_name. La soglia è fissata a 400 (E) e a 50 (E'). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Guida alla Risoluzione dei Problemi per i Diversi Tipi di Errori nella Segmentazione delle Immagini che possono essere Prodotti dalle Macro. Questa tabella descrive diversi tipi di errori di segmentazione delle immagini prodotti dalle macro. Questi possono essere facilmente rilevati nelle immagini dei risultati. Esempi di ciascun tipo di errore sono illustrati nella Figura 1. Nella "sezione delle regolazioni" della tabella, vengono evidenziate le impostazioni che devono essere regolate e si rimanda all'utente al passaggio secondario critico della sezione 6, che descrive come regolare queste impostazioni.