Lesione neurale indotta da laser a due fotoni: un metodo per osservare la degenerazione e la rigenerazione degli assoni nelle larve di Drosophila

Abstract

Source: Li, D., et al. Un modello di lesione in vivo di Drosophila per lo studio della neurorigenerazione nel sistema nervoso periferico e centrale. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive l'ablazione laser a due fotoni degli assoni in una larva di Drosophila melanogaster e un protocollo di esempio per indurre lesioni e visualizzare il sito della lesione.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. Lesioni a due fotoni e imaging confocale

1. Configurazione del microscopio
   NOTA: Per questo esperimento è stato utilizzato un microscopio a scansione laser confocale con un laser a due fotoni, ma saranno sufficienti anche altri sistemi con una configurazione equivalente. Il laser a due fotoni (930 nm) è stato utilizzato per l'erogazione di lesioni e un laser ad argon (488 nm) è stato utilizzato per l'imaging confocale della GFP.
   1. All'inizio di ogni sessione, accendere il laser a due fotoni e/o il/i laser/i confocale/i e il microscopio. Aprire il software di imaging.
   2. Per le lesioni da due fotoni, impostare i seguenti parametri per l'imaging GFP con il laser a due fotoni a 930 nm (1.950 mW).
      1. Selezionare la modalità di scansione lineare. Apri completamente il foro stenopeico. Aumentare l'intensità del laser a ~20% (390 mW).
      2. Selezionare 512 x 512 come scansione dei fotogrammi. Utilizzare la massima velocità di scansione (in genere con il tempo di permanenza dei pixel a 0,77 μs). Assicurarsi che il numero medio sia 1 e che la profondità di bit sia 8 bit.
      3. Impostate il guadagno su ~750 e l'offset su 0.
      4. Salva questo protocollo sperimentale preimpostato come ablazione 2P GFP 930, consentendone un facile riutilizzo in esperimenti futuri.
   3. Per l'imaging confocale, impostare i seguenti parametri per l'imaging GFP con il laser ad argon a 488 nm:
      1. Seleziona la scheda Acquisizione e poi Z-stack.
      2. Alla voce "Laser", accendere il laser Argon a 488 nm.
      3. Vai su Canali, seleziona il laser da 488 mm e aumenta la potenza del laser al 5-10%. Per il foro stenopeico, utilizzare l'unità 1-2 airy (AU). Regola il guadagno su 650.
      4. In modalità di acquisizione, selezionare 1024 x 1024 come scansione dei fotogrammi, utilizzare la velocità di scansione massima, un numero medio di 2 e una profondità di bit di 8 bit.
      5. Salva questo protocollo sperimentale preimpostato come GFP Imaging.
2. Anestesia larvale con etere etilico e montaggio
   1. In una cappa aspirante, posizionare una capsula di vetro da 60 mm in una capsula di Petri di plastica da 15 cm. Piegare e stendere un pezzo di carta velina sul fondo della pirofila di vetro, quindi posizionare un piatto di agar per succo d'uva sul fazzoletto. Aggiungere l'etere etilico nel piatto di vetro, fino al punto in cui la carta velina è imbevuta e rimane uno strato di etere liquido nel piatto. Tenere sempre il coperchio.
   2. Preparare un vetrino con una goccia di olio alocarbonico 27 al centro. Aggiungere 4 punti di grasso sottovuoto sui quattro angoli del vetrino, per sostenere successivamente il vetrino.
   3. Usa una pinza per raccogliere una larva pulita e posizionarla sulla piastra di agar nel piatto di vetro da 60 mm. Copri il piatto di vetro con il suo coperchio e attendi che la larva smetta di muoversi. Per lesioni/imaging PNS, estrarre la larva non appena la coda smette di contrarsi. Per il SNC, attendere che l'intera larva diventi immobile, in particolare i segmenti della testa.
      NOTA: La tempistica dell'esposizione all'etere è fondamentale. Vedi Discussione.
   4. Raccogli con cura la larva anestetizzata e posizionala a testa in su nella goccia di olio di alocarburi sul vetrino. Aggiungi un vetrino coprioggetti sopra il vetrino. Esercitare una leggera pressione per spingere verso il basso il vetrino coprioggetti, fino a toccare la larva (Figura 1A).
   5. Regola la posizione della larva spingendo delicatamente il vetrino coprioggetti verso sinistra o verso destra per far rotolare la larva, in modo che il neurone/assone/dendrite di interesse si trovi in alto e più vicino alla lente del microscopio.
   6. Per la lesione del PNS, montare la larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto, in modo che entrambe le trachee siano visibili. Quindi ruota la larva di ~30 gradi a sinistra per ferire gli assoni dei neuroni di classe III (Figure 1B e 1C), di 90 gradi per ferire gli assoni dei neuroni di classe IV (Figure 1B e 1E), o ~30 gradi per ferire i dendriti dei neuroni di classe IV (Figura 2A).
   7. Per le lesioni al SNC, posizionare la larva in modo che sia perfettamente ventrale verso l'alto (Figura 3A), in modo che la regione di interesse sia più vicina alla lente del microscopio nel piano z.
3. Lesione da laser a due fotoni
   1. Posizionare il vetrino con la larva sotto il microscopio e fissarlo in posizione con il supporto del vetrino sul tavolino. Usa l'obiettivo 10X (0,3 NA) per trovare la larva.
   2. Aggiungere 1 goccia di olio per obiettivi sul vetrino coprioggetti, passare all'obiettivo 40X (1,3 NA) e regolare la messa a fuoco.
   3. Passa alla modalità di scansione e riutilizza il protocollo sperimentale 2P GFP 930 Ablation. Assicurati che il foro stenopeico sia completamente aperto.
      NOTA: La configurazione deve essere ottimizzata in base ai singoli sistemi.
   4. Avviare la modalità Live per individuare la regione di interesse (ROI) e regolare le impostazioni per ottenere una buona qualità dell'immagine con lo zoom appropriato.
      NOTA: Lo scopo di questo passaggio è trovare il neurone/assone/dendrite da ferire, piuttosto che scattare l'immagine della migliore qualità. Pertanto, utilizzare le impostazioni minime sufficienti per visualizzare l'area target, al fine di evitare la sovraesposizione o il fotobleaching.
   5. Interrompi la scansione in tempo reale, in modo che il pulsante Ritaglia diventi disponibile. Lascia che l'immagine fissa funga da tabella di marcia. Selezionare la funzione Ritaglia e regolare la finestra di scansione per mettere a fuoco il bersaglio da ferire.
   6. Ridurre il ROI in modo che corrisponda alla dimensione del potenziale sito di lesione. Ad esempio, basta coprire la larghezza di un assone o di un dendrite, per garantire la precisione della lesione e ridurre i danni ai tessuti vicini. Se lo si desidera, ingrandire il ROI prima del ritaglio, consentendo lesioni più precise.
   7. Aprire una nuova finestra di imaging. Ridurre la velocità di scansione e aumentare l'intensità del laser. Determinare l'aumento dell'intensità del laser in base al segnale di fluorescenza tissutale scansionato in modalità Live.
   8. In genere, impostare l'intensità del laser a due fotoni a partire dal 25% per la lesione PNS e dal 50-100% per la lesione VNC. Per la lesione dell'assone PNS, assicurarsi che l'intensità del laser sia ~480 mW e che il tempo di permanenza dei pixel sia di 8,19 μs. Per la lesione dell'assone VNC, assicurarsi che l'intensità del laser e il tempo di permanenza dei pixel siano solitamente 965-1930 mW e 8,19-32,77 μs, rispettivamente.
   9. Avvia la scansione continua. Lascia il cursore al passaggio del mouse sul pulsante Continuo. Tenere d'occhio l'immagine e interrompere la scansione non appena si osserva un drastico aumento della fluorescenza.
      NOTA: La comparsa del picco di fluorescenza è dovuta all'autofluorescenza nel sito della lesione.
   10. Torna alla modalità Live riutilizzando le impostazioni. Trovare l'area di interesse che è stata appena presa di mira regolando il focus.
       NOTA: Una buona indicazione di una lesione riuscita è la comparsa di un piccolo cratere, una struttura ad anello o detriti localizzati proprio nel sito della lesione.
   11. Passa al neurone successivo e ripeti dal passaggio 1.3.5 per ferire più neuroni in un singolo animale. Oppure ripetere il passaggio 1.3.5 aumentando gradualmente la potenza e/o riducendo la velocità di scansione se la lesione iniziale era insufficiente.
       NOTA: Nel caso in cui la potenza del laser sia troppo alta, nell'immagine di scansione dal vivo post-infortunio sarà visibile un'ampia area danneggiata. Troppe lesioni possono causare la morte della larva.
   12. Recuperare la larva rimuovendo con cura il vetrino coprioggetti e trasferendo la larva ferita su una nuova piastra con pasta di lievito. Scavare diverse grotte sulla piastra di agar con una pinza; In alternativa, crea un'isola di agar nella piastra invece di utilizzare l'intera piastra, per ridurre la possibilità che la larva strisci fuori dalla piastra.
   13. Mettere la piastra in una piastra di Petri da 60 mm con tessuto umido (imbevuto di soluzione di acido propionico allo 0,5%) e coltura a temperatura ambiente o 25 °C.
       NOTA: La larva rimarrà allo stadio larvale per circa un giorno in più a temperatura ambiente (22 °C) rispetto ai 25 °C.
4. Imaging confocale post-infortunio
   1. Visualizzare la larva ferita nei punti temporali desiderati preparando la larva utilizzando la stessa procedura di anestesia e montaggio del passaggio 1.2, quindi l'imaging con il laser confocale.
      NOTA: Imaging della larva a 24 ore dopo la lesione (AI) per confermare la lesione assonale e a 48 ore AI (neuroni da di classe IV) o 72 ore AI (neuroni da di classe III) per valutare la rigenerazione.
   2. Localizza la larva usando l'obiettivo 10X, quindi passa a un obiettivo 25X (0,8 NA). Riutilizza il protocollo sperimentale GFP Imaging.
   3. Fai clic sul pulsante Live e trova lo stesso neurone ferito in precedenza.
   4. Impostare la prima e l'ultima posizione Z nella finestra di scansione in tempo reale. Premere stop e fare clic su Avvia esperimento per acquisire un'immagine Z-stack.
      NOTA: Assicurarsi che durante l'acquisizione delle immagini sia incluso un punto di normalizzazione (il punto di convergenza dell'assone) in modo che sia possibile quantificare la rigenerazione (Figura 1D, 1F) - questo è discusso ulteriormente nella sezione sull'analisi dei dati.
   5. Passa a Elaborazione immagini, seleziona l'immagine appena scattata e genera una proiezione di intensità massima. Salva sia le immagini z-stack che quelle di proiezione a massima intensità.

Risultati

Figura 1: La rigenerazione dell'assone del neurone Da nella periferia mostra una specificità di classe. (A e B) Disegno schematico che mostra la posizione delle larve. (C) Disegno schematico di neuroni da di classe III. (D) Gli assoni dei neuroni da ddaF di classe III, marcati con 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, non riescono a ricrescere. (E) Di...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etere dietilico, reagente ACS, anidro	Acros Organics	AC615080010
Olio alocarbonico 27	Genesee Scientifico	59-133
Acido propionico	J.T.Baker	U33007
Copri occhiali: Rettangoli	Fisher Scientifico	12-544-D	50 mm X 22 mm
Microscopio a scansione laser Zeiss LSM 880	Zeiss
Software Zen	Zeiss
Camaleonte Ultra II	coerente