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Questo protocollo è estratto da Catrina et al., Visualizzazione e tracciamento di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster vivace, J. Vis. Exp. (2019).
1. Progettazione di MB per l'imaging di cellule vive
- Piegare la sequenza di RNA target per prevedere la struttura secondaria del target mRNA utilizzando la "forma RNA" dal server mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- Incollare/caricare la sequenza target in formato FASTA, selezionare la sub-ottimalità del 5 o del 10% (strutture con un'energia libera di piegatura entro il 5 o il 10% del valore MFE, rispettivamente) e regolare di conseguenza il numero massimo di pieghe calcolate (ad es. maggiore per una sub-ottimali>NOTA: L'inclusione di strutture secondarie sub-ottimali durante la progettazione dei MB consente l'identificazione di regioni all'interno dell'mRNA bersaglio che possono essere più flessibili o più rigide di quanto previsto per la sola struttura a energia libera minima (MFE), il che migliora la progettazione complessiva dei MB adatti per l'imaging di cellule vive.
- Seleziona un "lavoro immediato" per target di mRNA di 800 nucleotidi (nt) o un "lavoro batch" per lunghezze di mRNA comprese tra 801 e 8.000 nt. Salva il file "ss-count" come semplice file di testo.
- Utilizzare il file "ss-count" ottenuto nel passaggio 1.1 come input per il programma PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) con i parametri desiderati, per progettare diversi MB per il target mRNA (vedere i tutorial che descrivono l'uso del programma PinMol all'indirizzo https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ ).
- Determinare la specificità dei MB selezionati eseguendo l'analisi BLAST: utilizzare "blastn" con il database appropriato (ad es. per i MB specifici dell'mRNA di oskar utilizzare il database "refseq-rna" e l'organismo Drosophila melanogaster).
- Identificare qualsiasi espressione tessuto-specifica del bersaglio dell'mRNA (ad es. per oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray o modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) e confronta con eventuali successi BLAST positivi. Eliminare le sonde che mostrano un'omologia incrociata del >50% con altri mRNA che sono espressi anche nel tessuto/cellula di interesse.
- Selezionare la coppia di fluoroforo e quencher appropriata per la configurazione di microscopia disponibile per eseguire l'imaging di cellule vive (ad es. Cy5/BHQ2).
2. MB Sintesi, Purificazione e Caratterizzazione
- Utilizzare la sintesi e la purificazione interne come precedentemente descritto in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006), o servizi di fornitori commerciali, per sintetizzare e purificare da uno a cinque MB (vedi nota sopra), utilizzando il seguente schema di etichettatura: [5'(Fluoroforo)-(Linker C3 o C6)-(Sequenza MB 2'-O-metil)-(Quencher)3']. Purificare i MB utilizzando l'HPLC in fase inversa, internamente o utilizzando i servizi del fornitore commerciale.
NOTA: Le fosforamiditi utilizzate per la sintesi automatizzata delle sonde devono avere la modifica del ribonucleotide 2'-O-metil. Si possono anche usare chimere di acido nucleico bloccato (LNA) alternato e modifiche 2'-O-metile per aumentare la stabilità di un ibrido tra un MB più corto e il suo mRNA bersaglio.
- Sintetizzare oligonucleotidi di DNA che corrispondono alla sequenza della regione di RNA bersaglio e quindi sono complementari alla regione della sonda dei MB, per l'uso nella caratterizzazione in vitro (vedere i passaggi da 2.3 a 2.5; nota sopra). Massimizzare l'ibridazione del MB con il mimico bersaglio DNA-oligonucleotidico, includendo su ciascuna estremità del bersaglio del DNA quattro nucleotidi aggiuntivi, come si trova nella sequenza di mRNA bersaglio.
NOTA: Una caratterizzazione più rigorosa dell'efficienza del MB nel rilevare la sequenza bersaglio può essere eseguita utilizzando bersagli di RNA sintetizzati in vitro invece di oligonucleotidi di DNA complementari.
- Eseguire la denaturazione termica del solo MB, misurare la sua temperatura di fusione (Tm) e confermare che il MB assuma la forma a forcina desiderata alla temperatura fisiologica. Abbiamo osservato valori di Tm compresi tra 60 e 90 °C.
- Eseguire la denaturazione termica del MB in presenza del bersaglio dell'oligonucleotide DNA e misurare il Tm dell'ibrido bersaglio MB:DNA, come precedentemente descritto in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Per l'ibrido MB:DNA è auspicabile una Tm compresa tra 55 e 60 °C.
- Eseguire reazioni di ibridazione in vitro con il corrispondente bersaglio oligonucleotidico del DNA e determinare l'efficienza della formazione di ibridi MB:DNA a temperatura fisiologica, come precedentemente descritto in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Si desidera una cinetica di ibridazione rapida con l'imitazione del bersaglio del DNA, tuttavia i MB che non mostrano un'elevata efficienza di ibridazione con i bersagli del DNA possono avere prestazioni migliori con l'mRNA bersaglio in vitro e/o in vivo.
3. Dissezione e preparazione di singole camere per uova per microiniezione
- Nutrire le femmine appena nate e accoppiate per 2-3 giorni con pasta di lievito fresca.
- Anestetizzare le mosche su un tampone di CO2 e, utilizzando una pinzetta fine (Dumont #5), trasferire 1-2 femmine in una goccia di olio di alocarbonio 700 su un vetrino coprioggetti.
- Usando un paio di pinzette, orienta la mosca con il lato dorsale rivolto verso l'alto sotto uno stereomicroscopio. Seziona l'addome femminile praticando una piccola incisione all'estremità posteriore e spremi delicatamente il paio di ovaie nell'olio.
- Espiantare le ovaie su una goccia d'olio su un nuovo vetrino coprioggetti. Tenere delicatamente un'ovaia con una pinzetta mentre si pizzicano gli stadi più giovani dell'ovariolo con l'altra pinzetta. L'mRNA di oskar è attivamente localizzato a metà dell'ovogenesi e dopo (stadi > 7) e le camere uovo più giovani (stadi < 7) sono più difficili da iniettare e non sopravvivono a lungo. Trascinare lentamente il vetrino coprioggetti (con un movimento verso il basso) fino a quando i singoli ovarioli o le camere delle uova non sono isolati e allineati verticalmente. Separare ulteriormente le camere delle singole uova spostando gli stadi indesiderati dalla catena delle uova ovarioli.
NOTA: Assicurarsi che le camere delle uova stuzzicate singolarmente non galleggino nell'olio e che aderiscano al vetrino coprioggetto. Questo è importante sia per il successo della microiniezione che per l'acquisizione delle immagini.
4. Microiniezione di MB nelle cellule nutrici delle camere delle uova
- Preparare la soluzione di MB, utilizzando un beacon molecolare (ad es. osk2216Cy5) o una miscela di due MB che hanno come bersaglio mRNA diversi e che sono marcati con fluorofori spettralmente distinti (ad es. osk2216Cy5 e drongo1111Cy3). Utilizzare una concentrazione di 200-300 ng/μL per MB in HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 e 100 mM NaCl). Per un cocktail di quattro MB marcati con lo stesso fluoroforo che hanno come bersaglio lo stesso mRNA a 200 ng/μL ciascuno in HybBuffer (ad es. osk82, osk1236, osk2216). Centrifugare la soluzione MB immediatamente prima di caricare l'ago per la microiniezione.
- Seleziona l'obiettivo. Si consiglia un obiettivo per olio 40x per trovare una camera delle uova appropriata e per eseguire la microiniezione.
- Montare il vetrino coprioggetti con la camera dell'uovo sezionata sul tavolino del microscopio. Portare l'obiettivo in posizione di messa a fuoco e identificare una camera uovo in una fase di sviluppo medio-tardiva, che sia correttamente orientata per la microiniezione (cioè con l'asse AàP perpendicolare alla punta dell'ago per consentire una facile iniezione all'interno di una cellula nutricea prossimale all'ovocita).
- Caricare un ago (commerciale o preparato internamente) con una soluzione MB da ~1 μL (vedere il passaggio 1.1) e collegarlo al microiniettore. Per le microiniezioni nelle camere delle uova di D. melanogaster, orientare l'ago (vedere Tabella dei materiali) con un angolo di <45° rispetto al tavolino del microscopio (ad es. 30°) per evitare di perforare diverse cellule nutrici.
- Impostare l'iniettore con una pressione di iniezione di 500-1.000 hPa e una pressione di compensazione di 100-250 hPa (vedi Tabella dei materiali).
- Muovi lentamente il palco per portare nel campo visivo un'area della goccia d'olio priva di camere delle uova.
- Utilizzando il joystick del micromanipolatore, abbassare delicatamente l'ago nella goccia d'olio e mettere a fuoco la punta verso la periferia del campo visivo.
- Eseguire una funzione di "pulizia" per rimuovere l'aria dalla punta dell'ago e per garantire che ci sia flusso dall'ago.
- Portare l'ago nella posizione iniziale e concentrarsi sulla camera dell'uovo da microiniettare, quindi riportare l'ago a fuoco e posizionarlo vicino al bordo della camera dell'uovo.
- Eseguire una regolazione fine della posizione Z dell'obiettivo in modo tale che la membrana che separa le cellule follicolari dalle cellule nutrici sia a fuoco.
- Inserire l'ago in una cella infermiera ed eseguire l'iniezione per 2-5 s.
- Rimuovere delicatamente l'ago e ritrarlo nella posizione iniziale.
- Modificare l'obiettivo all'ingrandimento desiderato per l'acquisizione dell'immagine (60-63x o 100x), mettere a fuoco la camera dell'uovo e iniziare l'acquisizione.