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Questo protocollo è un estratto da Du et al., Una strategia efficiente per la generazione di sistemi di trascrizione binaria specifici per i tessuti in Drosophila mediante l'editing del genoma, J. Vis. Exp. (2018).
1. Genetica e screening delle mosche (Figura 1 e Figura 2)
- Quando gli embrioni iniettati si sviluppano in adulti, incrocia ogni singola mosca G0 con mosche bilanciatrici. Selezionare il bilanciatore adatto per il cromosoma contenente l'allele bersaglio.
- Anestetizzare la prole F1 da ogni incrocio G0 su un tampone di CO2 e scegliere casualmente 10-20 maschi sotto uno stereomicroscopio. Incrociali individualmente con le femmine bilanciatrici come mostrato in Figura 2.
- Quando le larve F2 si schiudono, scegli il singolo padre F1 da ogni incrocio ed estrai il gDNA utilizzando il protocollo di preparazione del DNA genomico a mosca singola:
- Preparare il tampone di estrazione del gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, conservare a temperatura ambiente. Preparare 20 mg/mL di proteinasi K e conservare in congelatore.
- Metti ogni mosca in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml ed etichetta la provetta. Conservare in congelatore a -80 °C per una notte.
- Preparare un nuovo volume di lavoro di tampone di estrazione del gDNA contenente 200 μg/mL di concentrazione finale di proteinasi K.
Nota: non utilizzare un vecchio buffer per questo passaggio.
- Schiacciare ogni mosca per 10-15 secondi con un puntale per pipetta contenente 50 μl di tampone di schiacciamento senza erogare il liquido. Erogare il tampone rimanente nella provetta e mescolare bene. Incubare a 37 °C per 20–30 min.
- Mettere le provette in un blocco termico a 95 °C per 1-2 minuti per inattivare la proteinasi K.
- Centrifugare per 5 minuti a 10.000 x g. Conservare il preparato a 4 °C per ulteriori analisi PCR.
- Usa lo stesso metodo per preparare il gDNA da una mosca nos-Cas9, che funge da controllo negativo. Eseguire screening basati su PCR in tre fasi per identificare l'HDR corretto (Figura 1, Figura 3) utilizzando il gDNA di ciascun maschio F1 come modello5. Utilizzare 1 μL di DNA prep nel seguente sistema di reazione PCR: 10 μL di 2x PCR Master Mix with Dye, 1 μL di ciascun primer (10 μM), 1 μL di DNA pattern e 7 μL di ddH2O.
- Come mostrato in Figura 3A, eseguire la PCR utilizzando i primer fwd1 e rev1 per verificare l'esistenza dell'inserimento o della sostituzione; eseguire la PCR utilizzando i primer fwd2 e rev2 per verificare l'inserimento o la sostituzione dalla regione 3'; eseguire la PCR utilizzando i primer M13F e rev3 per verificare l'HDR "ends-in" (Tabella 1C).
- Mantieni le linee di mosca con l'HDR confermato e stabilisci stock bilanciati dalla generazione F2. L'incrocio con l'equilibratore vola di nuovo per rimuovere eventuali mutazioni involontarie su altri cromosomi.
