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Questo protocollo è un estratto da Koon et al., Preparazione di organismi procariotici ed eucariotici utilizzando l'essiccazione chimica per l'analisi morfologica in microscopia elettronica a scansione (SEM), J. Vis.(2019).
1. Preparazione e fissazione
- Preparare la Drosophila melanogaster (moscerino della frutta).
- Anestetizzare i moscerini adulti utilizzando il 100% di anidride carbonica. Mettere gli adulti anestetizzati (circa 10-30 mosche) in una piccola fiala di plastica con tappo a vite o in una provetta da centrifuga da 1,5 ml.
- Immergere le mosche anestetizzate in 1 mL di fissativo (glutaraldeide all'1,25%, tampone fosfato 0,1 M pH 7,2) per 2 ore (o durante la notte) a 4 °C. Se le mosche galleggiano sulla superficie del fissativo, aggiungere alcune gocce di polietilenglicole terz-ottilfeniletere al 2,5% per indebolire la tensione superficiale del fissativo consentendo la totale immersione del tessuto. Rimuovere il fissativo utilizzando una pipetta di vetro.
2. Lavaggio e disidratazione
- Lavare e disidratare la Drosophila melanogaster (mosca della frutta).
- Lavare il campione fissato tre volte con 1 mL di tampone fosfato 0,1 M pH 7,2 a temperatura ambiente per 10 minuti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Rimuovere ogni lavaggio con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non rimuovere le mosche.
- Disidratare il campione utilizzando una serie di etanolo graduato, per 10 minuti in un volume di 1 mL in una provetta per microfughe. Le concentrazioni di etanolo sono: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Rimuovere l'etanolo con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non rimuovere le mosche.
- Conservare il campione nella provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con una quantità di etanolo al 100% sufficiente a coprire il campione prima dell'essiccazione.
3. Asciugatura
- Eseguire l'essiccazione chimica utilizzando l'esametildisilazano (HMDS).
- Sostituire la soluzione di etanolo al 100% con una soluzione 1:2 di HMDS ed etanolo al 100% per 20 minuti. Sostituire la soluzione 1:2 con una soluzione 2:1 di HMDS ed etanolo al 100% per 20 minuti. Sostituire la soluzione 2:1 con HMDS al 100% per 20 minuti. Ripetere una volta.
Nota: l'HMDS è infiammabile ed è una tossina acuta (via dermica). L'HMDS deve essere maneggiato in una cappa chimica utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi.
- Trasferire il campione in HMDS, se in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, in un piatto di pesata monouso in alluminio. Una volta nel piatto di pesata in alluminio, sostituire l'HMDS al 100% con un HMDS al 100% fresco sufficiente a coprire il campione.
- Trasferire il campione in un essiccatore non sottovuoto di plastica o vetro con essiccante fresco (5-6 cm di profondità) e inserirlo in una cappa chimica. In alternativa, posizionare il campione direttamente in una cappa chimica per asciugarlo con un coperchio allentato, come una scatola, per evitare che i detriti cadano sul campione. Lasciare asciugare il campione per 12-24 ore.
4. Montaggio
- Monte Drosophila melanogaster (mosca della frutta).
- Etichettare la parte inferiore del mozzo di montaggio in alluminio per indicare cosa viene posizionato sopra.
Posizionare le mosche essiccate nella posizione desiderata su una linguetta adesiva o adesiva al carbonio fissata alla parte superiore di un troncone sotto un microscopio da dissezione con una pinzetta di precisione.
- Applicare l'adesivo conduttivo all'argento, cioè la vernice all'argento, attorno ai bordi esterni dei mozziconi. Collega la vernice argentata alle mosche usando uno stuzzicadenti per garantire la conduttività. Non lasciare che la vernice tocchi l'area di imaging desiderata.
- Metti i tronchetti in una scatola portatronchetti e metti la scatola portatronchetti aperta in un essiccatore. Lasciare asciugare la vernice argentata per almeno 3 ore o durante la notte per ottenere i migliori risultati.