Questo protocollo è un estratto da Sunderhaus e Kretzschmar, Istologia di massa per quantificare la neurodegenerazione in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Fissare la testa sui collari e incorporarla nella paraffina
NOTA: Tutti i passaggi del processo di fissaggio dovrebbero essere eseguiti in una cappa aspirante. Il metilbenzoato, pur non rappresentando un rischio per la salute, ha un odore molto distinto, che può essere opprimente se non viene maneggiato in una cappa aspirante.
- Prima di anestetizzare le mosche, preparare 50 ml di soluzione di Carnoy aggiungendo 15 ml di cloroformio e 5 ml di acido acetico glaciale a 30 ml di etanolo al 99% (non mescolare il cloroformio e l'acido acetico). Versalo in un contenitore di vetro con fondo piatto, come un piatto di cristallizzazione, per assicurarti che i collari possano essere appiattiti e siano completamente coperti dalla soluzione.
- Anestetizzare le mosche con CO2 o etere.
- Infilare le mosche (fino a 20 con la maggior parte dei collari) per il collo nei collari usando una pinza. Ricordati di allineare tutte le teste con lo stesso orientamento, come mostrato in Figura 1A, e sii gentile per assicurarti che non si verifichino danni alla testa o agli occhi.
- Includi mosche sine oculis (frecce, Figura 1A) in posizioni casuali in modo che l'ordine delle mosche possa essere facilmente identificato nelle sezioni. Inoltre, se le mosche sperimentali hanno un colore degli occhi chiaro o bianco, infilare alcune mosche dagli occhi rossi, come il tipo selvatico, tra di loro per assicurarsi che sia presente una quantità sufficiente di pigmento per colorare il vetrino. Registrare l'ordine delle mosche su un foglio di protocollo insieme al numero del collare se si utilizza più di un collare.
- Una volta terminato il collare, immergerlo nella soluzione di Carnoy preparata per 3,5 - 4 ore.
- Versare la soluzione di Carnoy nell'apposito contenitore di smaltimento e iniziare i lavaggi con etanolo. Assicurati di versare lentamente per non disturbare il posizionamento dei collari nel contenitore.
- Lavare i collari per 30 minuti in etanolo al 99% due volte.
- Lavare i collari in etanolo al 100% per 1 ora. Assicurati di cambiare i lavaggi in tempo per evitare un'eccessiva disidratazione.
- Mettere i collari nel metilbenzoato O/N a RT. Sigillare il contenitore con parafilm per evitare l'evaporazione del metilbenzoato.
- Versare il metilbenozate nell'apposito contenitore monouso della cappa. Aggiungere una miscela precedentemente preparata di cera di paraffina 1:1 a basso punto di fusione (56 - 57 °C) e metilbenzoato. Da questo momento in poi, i collari devono essere conservati in un'incubatrice a 65 °C per assicurarsi che la paraffina non si indurisca.
- Versare la miscela di metilbenozate e paraffina nell'apposito contenitore monouso e versare la cera di paraffina pura fusa, mantenuta a 65 °C, sui collari.
- Cambiare la paraffina dopo 30 minuti e ripetere l'operazione almeno 5 volte. Dovrebbero essere eseguiti almeno 6-8 lavaggi.
- Una volta completati i lavaggi, posizionare i collari in una vaschetta per cubetti di ghiaccio in gomma con fessure delle dimensioni approssimative dei collari. Versare la paraffina fusa su di essi fino a coprirli completamente e lasciarla indurire O/N (cercare di evitare bolle d'aria).
- Rimuovere i blocchi di paraffina contenenti i collari dalla vaschetta dei cubetti di ghiaccio. Separare il blocco di paraffina dal collare usando una lama di rasoio, rompendo delicatamente il collare. Le teste saranno nel blocco di paraffina mentre i corpi rimarranno nel colletto. I blocchi possono essere conservati a temperatura ambiente.
- Per pulire i collari, immergerli in un agente deparafinizzante a 65 °C per rimuovere la paraffina, pulire con un leggero strofinamento e lavare in etanolo prima di riutilizzarli.
