Questo protocollo è un estratto da Nazario-Toole e Wu, Valutazione della risposta immunitaria cellulare del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, utilizzando un saggio di fagocitosi in vivo, J. Vis. Exp. (2019).
1. Prepara le particelle di fluoresceina per l'iniezione
- Ricostituire 10 mg di particelle batteriche uccise termicamente disponibili in commercio marcate con fluoresceina (vedere la Tabella dei materiali) a una concentrazione stock di 10 mg/mL aggiungendo 990 μL di 1x PBS sterile e 10 μL di 50 mM di azoturo di sodio. Vortice per mescolare.
- Dividere in aliquote monouso da 8 μL in provette da 0,2 mL e conservare in una scatola scura a 4 °C per ridurre al minimo la sensibilità associata alla luce.
NOTA: Il conservante sodio azide è facoltativo e può essere omesso se si preparano scorte da 10 mg/mL con 1 mL di PBS sterile, aliquotato e conservato a -20 °C.
- Preparare una soluzione da 10 ml di colorante alimentare al 5% in 1x PBS mescolando 500 μL di colorante alimentare verde filtrato da siringa e 9,5 mL di 1x PBS sterile.
- Lavare le particelle prima dell'iniezione per rimuovere l'azide di sodio. Miscelare 42 μL sterili 1x PBS e 8 μL di 10 mg/mL in una provetta da 1,7 mL. Centrifugare alla massima velocità per 2,5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante, aggiungere 50 μl di 1x PBS e centrifugare alla massima velocità per 2,5 minuti a temperatura ambiente.
- Ripetere i passaggi 1.3 e 1.3.1 2 volte, per un totale di 3 lavaggi.
- Dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere le particelle a 1,6 mg/mL in 50 μL di colorante alimentare al 5% in 1x PBS.
- Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Conservare a 4 °C, gettare dopo 1 settimana.
2. Prepara la stazione di iniezione e vola
- Preparare il tampone di iniezione. Per iniettare fino a 4 genotipi di mosche contemporaneamente, utilizzare del nastro da laboratorio per dividere un cuscinetto rettangolare di CO2 in 4 sezioni. Sul banco vicino al microscopio, designare le aree in cui posizionare le fiale una volta che le mosche sono state allineate sul pad (una per ogni angolo del pad).
- Preparare fiale di mosche di 4-7 giorni di età uguale per l'iniezione. Per ogni ceppo da testare, trasferire 5 maschi e 5 femmine in una fiala fresca ed etichettata di cibo preparato per mosche e conservare a 25 °C.
- Preparare l'iniettore pneumatico (vedi Tabella dei materiali) impostando lo strumento su una modalità TEMPORIZZATA di 100 ms (brevi raffiche di pressione del gas per espellere il liquido, consentendo l'erogazione di volumi inferiori ai nanolitri).
- Preparare i vetrini del microscopio. Tagliare strisce di nastro isolante da 1,5 pollici, piegarle in un cappio con il lato adesivo rivolto verso l'esterno e posizionarle su un vetrino da microscopio etichettato.
3. Prepara gli aghi capillari in vetro
- Estrarre gli aghi di vetro (capillari di vetro a parete sottile) utilizzando un estrattore di aghi.
- Tenere l'ago sotto il microscopio con un micrometro e rompere la punta usando una pinzetta in acciaio inossidabile a punta fine #5. Le punte da 100 μm sono sufficienti per perforare la cuticola della mosca riducendo al minimo le ferite.
- Misurare il volume di liquido che verrà iniettato in ogni mosca. Caricare l'ago con colorante alimentare sterile al 5% in 1x PBS ed espellere il liquido su una goccia di olio minerale su un micrometro da 0,01 mm.
NOTA: Se la gocciolina di liquido è sferica, il volume nei picolitri viene calcolato come (dimensione)3/1910. Un ago con un diametro di 100 μm espellerà ~2 nL in 100 ms.
4. Inietta mosche
- Pipettare 10 μL di particelle da 1,6 mg/mL su un quadratino di parafilm.
- Tirare il liquido nell'ago e montarlo nell'ugello dell'iniettore (vedere la Tabella dei materiali).
- Anestetizzare le mosche con CO2 e allinearle nell'area designata sul flypad, con il lato ventrale rivolto verso l'alto e le teste orientate verso la parte anteriore del pad. Posizionare le fiale nelle aree corrispondenti del banco.
- Iniettare mosche nell'angolo superiore dell'addome con 5, 100 ms di pompe di liquido (~10 nL in totale).
- Trasferire le mosche iniettate nelle apposite fiale e annotare l'ora sulla fiala. Conservare a 25 °C.
- Caricare un nuovo ago con la soluzione di blu di tripano allo 0,4%.
- Impostare l'iniettore pneumatico su GATED, che consente a un flusso d'aria costante di spingere il liquido fuori dall'ago.
- Anestetizzare le mosche dopo che hanno riposato per 30 minuti e iniettare con Trypan Blue fino a quando l'addome è pieno e disteso.
NOTA: Quando si esamina la maturazione dei fagosomi con particelle marcate con un colorante sensibile al pH, lasciare riposare le mosche per 1 ora e non iniettare con blu di tripano prima di montare le mosche.
- Montare le mosche sui vetrini del microscopio con nastro isolante, lato ventrale rivolto verso il basso. Spingi le ali sul lato della mosca e fissale al nastro. Inoltre, spingi delicatamente la testina nel nastro per assicurarti che la mosca non si muova.
