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Questo protocollo è un estratto da Bantel e Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Fame
- Preparare fiale per la fame di mosche saturando un batuffolo di cotone con 18,2 MΩ di acqua sul fondo di una fiala per mosche standard. In alternativa, allo stesso modo, saturare una piccola striscia di carta da filtro con 18,2 MΩ di acqua e posizionarla ad angolo all'interno della fiala.
- Raccogli le mosche in gruppi di ~100 animali su un tampone di CO2 e poi aggiungi le mosche in una fiala preparata.
NOTA: I migliori risultati si ottengono con animali di età inferiore a 5 giorni. Tuttavia, l'età esatta degli animali può essere controllata come variabile sperimentale per determinare i cambiamenti nelle preferenze di gusto nel tempo.
- Utilizzare un batuffolo di cotone o un tappo di schiuma per fissare le fiale chiuse. Posizionare le fiale su un lato in un'incubatrice a controllo ambientale. Mantenere la temperatura a 25 °C e l'umidità sopra il 70%. Lasciare intatte le fiale per 24 ore.
2. Saggio delle preferenze gustative
- Preparare tutti i prodotti per il test lo stesso giorno del test.
NOTA: I gusti esatti da utilizzare variano a seconda della domanda sperimentale che viene posta. Di seguito sono riportati alcuni esempi di astanti utilizzati in questo protocollo. Vedere la sezione 4 per le ottimizzazioni.
- Preparare il tastant di controllo (1 mM di saccarosio) combinando 10 μl di soluzione di saccarosio 100 mM, 13 μl di colorante alimentare rosso e 977 μl di acqua da 18,2 MΩ.
- Preparare il tastant sperimentale (5 mM di saccarosio) combinando 50 μl di soluzione di saccarosio 100 mM, 10 μl di colorante alimentare blu e 940 μl di acqua da 18,2 MΩ.
- Realizzare camere di saggio utilizzando una capsula di Petri in plastica standard da 100 mm x 15 mm preparata nel modo seguente:
- Porre tre gocce da 10 μl di tastant di controllo più vicino al bordo della piastra a ore 12 e altre 3 gocce a ore 6. Assicurarsi che la distanza tra le gocce sia simile.
- Porre tre gocce da 10 μl di tastant sperimentale in prossimità del bordo della piastra a ore 3 e altre 3 gocce a ore 9. Assicurarsi che la distanza tra le gocce sia simile.
- Ripetere i passaggi 2.2.1 e 2.2.2 per il numero di repliche desiderato.
- Svuotare 1 fiala di ~100 mosche affamate su un tampone di CO2 giusto il tempo necessario per anestetizzare tutti gli animali (circa 10 secondi). Spennellare gli animali al centro di una camera di analisi preparata e coprire con il coperchio della piastra.
NOTA: Periodi più lunghi di esposizione alla CO2 dovrebbero essere evitati per migliorare i tempi di recupero e limitare l'interferenza con il comportamento alimentare. L'esposizione al ghiaccio (~5 min) può essere utilizzata per l'anestesia per evitare effetti comportamentali di CO2 che possono derivare da un'esposizione anche limitata.
- Collocare la camera di analisi in una scatola di cartone opaco. Assicurati di etichettare l'esterno della scatola con la condizione e il genotipo da testare.
- Collocare l'intera configurazione (camera di saggio contenuta nella scatola di cartone della fase 2.4) in un incubatore a 25 °C con almeno il 70% di umidità per 2 ore.
- Ripetere i passaggi da 2.3 a 2.5 per tutte le repliche.
- Dopo 2 ore, posizionare le camere di analisi, ancora contenute in scatole di cartone, direttamente in un congelatore a -20 °C fino al momento della quantificazione.
3. Quantificazione del saggio delle preferenze gustative
- Lasciare che una singola camera di saggio si riscaldi a temperatura ambiente (circa 5 minuti).
- Sotto un microscopio da dissezione, usando un pennello o un paio di pinze, raggruppare gli animali in base al colore del loro addome: rosso, blu, viola o chiaro (Figura 1).
- Registra il numero di animali in ogni raggruppamento. Considerare gli animali chiari come non aver partecipato al test e quindi non includerli in alcun calcolo.
- Calcola l'indice di preferenza in base a una delle seguenti equazioni:
- Se il sapore sperimentale di interesse viene aggiunto al colorante rosso, utilizzare (Nrosso + 0,5 Nviola)/(Nrosso + Nblu + Nviola).
- Se il sapore sperimentale viene aggiunto al colorante blu, allora aggiusta l'equazione a (Nblu + 0,5Nviola)/(Nblu + Nrosso + Nviola).
- Ripetere i calcoli per tutte le condizioni sperimentali e le repliche.
4. Ottimizzazione del Saggio delle Preferenze di Gusto
- Determinare empiricamente la concentrazione degli indicatori di colorante alimentare da utilizzare in modo che il colorante alimentare non influisca sull'esito del test del gusto, come segue:
- Preparare 4 astanti utilizzando lo stesso composto di base (es. 5 mM di saccarosio) come indicato al punto 2.1, ma omettere il colorante alimentare.
- Aggiungi l'1,3% di colorante alimentare rosso a uno dei gusti. Prepara i restanti 3 astanti con colorante alimentare blu di concentrazioni variabili in ogni provetta (ad es. 0,6%, 1% e 1,3%).
- Completare i passaggi del protocollo da 2.2 a 3.4 per ogni coppia di tasti: 1,3% rosso contro 0,6% blu; 1,3% rosso contro 1% blu e 1,3% rosso contro 1,3% blu.
- Ripetere i passaggi 4.1.1-4.1.3 con diverse percentuali di colorante alimentare blu fino a quando l'indice di preferenza non raggiunge in media un valore di 0 (Figura 2).
NOTA: Come punto di partenza, l'1,3% di colorante alimentare rosso abbinato all'1% di colorante alimentare blu produce in genere buoni risultati. Se non è possibile abbinare una concentrazione soddisfacente di colorante alimentare blu all'1,3%, i passaggi da 4.1.1 a 4.1.3 possono essere ripetuti con concentrazioni variabili di colorante rosso e una concentrazione costante di colorante alimentare blu.
- Analizza tutte le condizioni da testare con le stesse concentrazioni ottimizzate di coloranti alimentari.
