Il test CApillary FEeder (CAFE): un metodo per monitorare il consumo e la preferenza alimentare in Drosophila

Abstract

Fonte: Diegelmann, S., et al. Il test CApillary FEeder misura l'assunzione di cibo in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video descrive il test CApillary FEeder, o CAFE, un metodo comportamentale che misura l'assunzione di cibo e la preferenza dei moscerini della frutta non frenati. Il protocollo presentato mostra come eseguire il test con un'evaporazione minima dai capillari pieni di liquido utilizzati per erogare il cibo e monitorarne l'assunzione.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Assemblaggio ed esecuzione del test FEeder CApillary

1. Se il digiuno non è necessario, trasferire le mosche sperimentali al saggio picchiettando o mediante cerbottana. Assicurati di includere tre fiale di controllo senza mosche per quantificare l'evaporazione.
2. Rimuovere con cautela il puntale della pipetta (volume da 2 a 20 μl) che chiude una delle aperture esterne e inserire un capillare di vetro riempito, con l'estremità inferiore. Fissare il capillare riposizionando il puntale della pipetta accanto al capillare. Se vengono testate più soluzioni alimentari, ripetere questa procedura di conseguenza.
3. Posizionare le estremità dei capillari all'interno di tutte le fiale allo stesso livello per evitare distorsioni che potrebbero verificarsi se le fonti di cibo si trovassero ad altezze diverse (3 - 4 cm dal coperchio); mantenere una distanza dalla carta da filtro per evitare che il capillare fuoriesca toccando accidentalmente la carta da filtro o diverse viscosità delle fonti di cibo.
4. Etichettare l'estremità superiore del liquido colorato utilizzando un pennarello (_{segnare l'inizio}). Per garantire l'identificazione dei diversi capillari, etichettarli singolarmente utilizzando un codice colore o una striscia.
5. Posizionare più saggi CAFE preparati all'interno di una scatola di plastica con intarsio a griglia e trasferire la scatola (Figura 2A) in una posizione sicura in condizioni di laboratorio o in una camera climatica a temperatura, luce e umidità controllate (parametri: 25 °C, 60% di umidità relativa, ciclo luce-buio 12 ore/12 ore) per il periodo sperimentale (ad es. 3 ore o giorni).
6. Poiché la carta da filtro inferiore si asciuga se il test viene eseguito per diversi giorni, applicare acqua fresca ogni 24 ore attraverso il tappo di spugna (100 μL) per mantenere costante l'umidità all'interno del test. Utilizzare quattro fiale separate (8 cm di altezza, 3,3 cm di diametro) riempite con 30 mL di ddH₂O come dispositivi di umidità e posizionarle accanto ai dosaggi CAFE nella scatola di plastica. Utilizzare un coperchio per la scatola di plastica per creare un ambiente a umidità controllata durante l'esperimento (Figura 2A).
   NOTA: Una variabilità più ampia si verifica in condizioni di laboratorio; tuttavia, è possibile eseguire il test CAFE a temperatura ambiente (ad esempio, in un'aula). L'uso di un dispositivo di umidificazione (carta da filtro, con o senza tappo di spugna bagnato, fiale d'acqua piene e coperchio per la scatola di plastica) è altamente incoraggiato per ridurre l'evaporazione (Figura 2B).
7. Sostituire i capillari con quelli appena riempiti per esperimenti a lungo termine ogni 24 ore. Prendere nota delle mosche morte prima di ogni intervallo di 24 ore e utilizzare il numero di mosche vive per calcolare il consumo per mosca per il periodo successivo. Eliminare i vecchi capillari dopo aver misurato il declino del menisco (vedi 2.1).
   NOTA: Durante un esperimento di 3 ore non vediamo quasi nessuna mosca morta. Durante uno studio di 4 giorni di solito troviamo 1 - 3 mosche morte.
8. Al termine del test o prima di sostituire il capillare, marcare il menisco inferiore del capillare (_{mark end}) con un pennarello mentre il test CAFE è ancora in posizione verticale. Eliminare i dati se la_fine della tacca non è inferiore alla tacca iniziale (_{inizio della} tacca). Non rimuovere il coperchio, poiché ciò potrebbe modificare il menisco.
9. Rimuovere con cautela i capillari dal test e conservarli per la raccolta dei dati. Controllare se il liquido all'interno del capillare ha raggiunto l'estremità inferiore se non scartare i dati, poiché il cibo non era accessibile alle mosche. Raccogliere tutti i capillari per fiala in gruppo. Inserire i puntali delle pipette non tagliati in tutte le aperture per evitare la fuoriuscita delle mosche. Smontare la configurazione e lavare le fiale, i coperchi e i tappi di spugna in un bagno di sapone e asciugare per una notte a temperatura ambiente per un ulteriore utilizzo.
   NOTA: Le mosche possono essere ulteriormente analizzate dopo il test. Confermare l'assorbimento del cibo a occhio o al microscopio da dissezione.
10. Ripetere gli esperimenti con gli stessi genotipi in almeno tre giorni diversi.

2. Raccolta e analisi dei dati

1. Misurare la distanza tra_l'inizio e la_fine del segno sul capillare utilizzando un calibro o un righello. Per trasferire i dati direttamente su un foglio di calcolo, utilizzare un calibro digitale collegato tramite USB (Universal Serial Bus) (Figura 1E). Eliminare i capillari dopo la misurazione.
2. Tenere conto delle dimensioni dei capillari per calcolare l'assorbimento o l'evaporazione del cibo. Ad esempio, si consideri un capillare lungo 73 mm e contenente 5 μL di soluzione alimentare. Una diminuzione di 14,6 mm nel menisco riflette l'assorbimento di 1 μL di soluzione. Calcolare l'assorbimento di cibo utilizzando la seguente formula:
   Assorbimento di cibo (μL) = distanza misurata (mm)/ 14,6 mm
3. Per escludere l'effetto dell'evaporazione sull'assunzione di cibo, calcolare l'evaporazione media nelle tre fiale di controllo (almeno) senza mosche. Sottrarre questo valore medio dal valore ottenuto per il consumo alimentare dalle mosche.
4. Utilizzare la seguente formula per determinare il consumo totale per mosca:
   Consumo di cibo (μL) = (Assorbimento di cibo [μL] - Perdita per evaporazione [μL])/numero totale di mosche nella fiala. Per esperimenti a lungo termine, utilizzare il numero di mosche vive prima dell'inizio dell'intervallo di 24 ore.
5. Per tenere conto delle differenze nelle dimensioni corporee, ad esempio tra mosche maschi e femmine, normalizzare il consumo di cibo in base al peso corporeo (μL di cibo/mg di mosca).
6. Utilizzare software statistici per l'analisi dei dati. Per i dati normalmente distribuiti, utilizzare i test T di Student per determinare le differenze tra due gruppi di mosche e utilizzare l'ANOVA (analisi della varianza) con test post hoc di Tukey Cramer per più di due gruppi. In una situazione di scelta, analizzare le differenze dalla scelta casuale utilizzando un test del segno a campione singolo non parametrico.

Risultati

Figura 1: Il saggio CApillary FEeder di Drosophila melanogaster. A) Il test di alimentazione con le mosche. La carta da filtro inumidita fornisce acqua sul fondo della fiala. Durante l'esperimento vengono forniti quattro capillari (cibo di colore rosso e blu nei capillari opposti). Si noti che i capillari sono fissati in posizione da un secondo puntale per pipetta e che le posizioni inutilizzate...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fiale (allevamento)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Fiale (saggio CAFE)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Saggio Lid-CAFE	officina	–	–
Scatola di plastica, muretto	Piattaforma	353	www.plastime.it
Coperchio per la scatola di plastica	officina	–	–
Capillari	BLAUBRAND	RIFERIMENTO 7087 07	www.brand.de
Puntali per pipette	Greiner Bio-One	Codice: 771290	www.greinerbioone.com
Cerchi di carta da filtro	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Saccarosio	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Etanolo assoluto	Prodotti chimici VWR	20.821.330	www.vwr.com
Colorante alimentare (rosso, E124)	Divertimento sulla schiena	Codice 10027	www.backfun.de
Colorante alimentare (blu, E133)	Divertimento sulla schiena	Codice: 10030	www.backfun.de
Soluzione di sapone (CVK 8)	CVH	Codice 103220	www.cvh.de
Calibro digitale	GARANT	412.616	www.hoffmann-group.com
Fiale (allevamento)			Altezza 9,8 cm, diametro 4,8 cm
Fiale (saggio CAFE)			Altezza 8 cm, diametro 3,3 cm
Saggio Lid-CAFE			Prodotto in officina universitaria, disegno tecnico fornito Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Scatola di plastica, muretto			Un inserto a griglia in plastica è stato realizzato su misura per le posizioni delle fiale 8 x 10
Coperchio per la scatola di plastica			Dimensioni (37 x 29 x 18 cm)
Capillari			Norma DIN ISO 7550, direttiva IVD 98/79 EG, estremità lucidate
Puntali per pipette			Le pipette per il cerchio esterno vengono tagliate in base al coperchio
Cerchi di carta da filtro			Il diametro di 45 mm funziona bene se piegato per le fiale utilizzate
D(+)-Saccarosio			Non dannoso
Etanolo assoluto			Liquidi e vapori altamente infiammabili
Colorante alimentare (rosso, E124)			Non dichiarato
Colorante alimentare (blu, E133)			Non dichiarato
Soluzione di sapone (CVK 8)			Sapone inodore neutro
Calibro digitale
Cibo standard per mosche			(per 20 L)
agar			160 g
Lievito di birra			299,33 g
Mais			1.200 g
melassa			1,6 L
Acido propionico			57,3 ml
Nipagin 30%			160 ml