Questo protocollo è un estratto da Tenenbaum e Gavis, Rimozione del tessuto muscolare di Drosophila dai filetti larvali per l'analisi dell'immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e delle cellule epidermiche, J. Vis.(2016).
NOTA: La procedura per la rimozione del muscolo (Figura 1) è una modifica dei metodi precedentemente descritti per la preparazione dei filetti larvali. I passaggi che precedono e seguono la rimozione muscolare sono delineati brevemente e il lettore è rimandato a lavori precedenti in Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) e Karim e Moore, J. Vis. Exp. (2011) per descrizioni più dettagliate.
1. Seziona la larva nella soluzione salina fredda
- Preparare una diluizione di lavoro di soluzione salina fredda HL3.1 o soluzione salina fredda di HL3.1 priva di Ca2+ (Tabella 1). Metti la larva in un piatto di elastomero siliconico con soluzione salina fredda quanto basta per coprire il fondo del piatto.
NOTA: Si consiglia di sperimentare l'uso di soluzione salina HL3.1 priva di Ca2+ rispetto alla soluzione salina HL3.1 standard durante la dissezione larvale. In assenza di calcio, le contrazioni muscolari larvali sono notevolmente ridotte. Pertanto, i filetti larvali possono essere più facili da manipolare quando sezionati in soluzione salina HL3.1 priva di Ca2+. Tuttavia, scopriamo che la contrazione muscolare crea spazio tra il muscolo e l'epidermide e questo può facilitare l'inserimento di pinze tra questi tessuti, riducendo al minimo il rischio di danni all'epidermide. Di conseguenza, l'HL3.1 standard può essere preferibile per preservare l'integrità dell'epidermide e dei neuroni da. Otteniamo buoni risultati con entrambe le soluzioni saline e la scelta è lasciata all'utente.
- Posizionare la larva con il lato ventrale rivolto verso l'alto. La superficie ventrale della larva può essere identificata dalle cinture dentali addominali e il lato dorsale dai tubi tracheali larvali primari che vanno dalla parte anteriore a quella posteriore. Allungare la larva in direzione antero-posteriore e fissare la testa e la coda a un piatto di dissezione in elastomero siliconico utilizzando spilli per insetti. Usa le forbici da dissezione fine per tagliare lungo la linea mediana ventrale, iniziando da un'estremità e progredendo verso l'altra.
NOTA: Questo orientamento preserva il cluster dorsale comunemente studiato dei neuroni da.
- Dopo che la larva è stata tagliata, appuntare i quattro angoli al piatto di dissezione come se aprissi un libro. Usa il forcipe per afferrare e rimuovere gli organi interni, tra cui il SNC, l'intestino e la trachea. Regolare i perni degli insetti in modo che il raccordo sia teso ma non allungato al massimo.
NOTA: I muscoli sono ancorati alla parete corporea ai confini segmentali. Sebbene i muscoli coprano la maggior parte della parete corporea, sono assenti in una regione stretta vicino alla linea mediana dorsale.
2. Rimozione Muscolare
- Localizzare la linea mediana dorsale della larva, dove il tessuto muscolare è assente. Posizionare un singolo polo della pinza in modo che possa essere inserito sotto il tessuto muscolare con l'orientamento più piatto possibile.
- Partendo dalla linea mediana dorsale, vicino al limite anteriore del segmento, far scorrere con cautela il polo della pinza tra il muscolo e l'epidermide, facendo attenzione a ridurre al minimo il contatto tra la pinza e l'epidermide.
- Tirare la pinza verso l'alto per rompere l'attacco del muscolo alla parete del corpo in un punto di ancoraggio. Ripetere questa procedura per i restanti emisegmenti di interesse.
NOTA: Questo protocollo ottimizza la conservazione della parte posteriore di ciascun campo dendritico di neuroni da. Per preservare la parte anteriore del campo dendritico, è meglio inserire il polo della pinza all'estremità posteriore di ciascun segmento.
- Regolare nuovamente i perni degli insetti in modo che il filetto larvale sia allungato al massimo in tutte le direzioni.
- Fissare il filetto mentre è ancora appuntato al piatto da dissezione utilizzando formaldeide fredda al 4% preparata al momento in PBS per 25 minuti.
- Risciacquare 5 volte in PBS.
- Usa una pinza per estrarre con cura il tessuto muscolare dai punti di ancoraggio rimanenti, facendo attenzione a ridurre al minimo il contatto con l'epidermide.
- Sganciare e rimuovere il filetto dal piatto di dissezione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Eseguire tutte le successive fasi di lavaggio, blocco e colorazione in immunofluorescenza, come precedentemente descritto in Karim e Moore, J. Vis. (2011).
