Dissezione della ghiandola linfatica larvale: isolamento dell'organo produttore di emociti della Drosophila

Abstract

Fonte: Reimels, T. A. e Pfleger, C. M. Metodi per esaminare la ghiandola linfatica e gli emociti nelle larve di Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video descrive la ghiandola linfatica di Drosophila, il sito primario dell'emopoiesi nella larva di mosca, e mostra un esempio di protocollo per sezionare e montare l'organo per l'immunoistochimica e l'imaging fluorescente.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Reimels e Pfleger, Metodi per esaminare la ghiandola linfatica e gli emociti nelle larve di Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Immunoistochimica delle ghiandole linfatiche larvali

NOTA: La ghiandola linfatica si trova a circa un terzo di lunghezza dall'estremità anteriore di una larva leggermente sotto il cervello sul lato dorsale. (Vedi freccia in Figura 1B.) La ghiandola linfatica fiancheggia il vaso dorsale ed è più facilmente sezionata attaccata ai ganci della bocca o al cervello. Le ghiandole linfatiche di terzo stadio wild-type sono strutture molto piccole; I lobi primari sono lunghi circa 100 - 200 μm. (Vedi Figura 2A.)

Per ottenere larve all'incirca dello stesso stadio di sviluppo per questo test, limitare la raccolta delle uova consentendo alle femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2 - 6 ore.
Dissezione delle ghiandole linfatiche
1. Per ogni condizione sperimentale, aggiungere 1 ml di 1x PBS (Tabella 1) a un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
2. Aggiungere 1 goccia di PBST allo 0,1% (Tabella 1) a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta di trasferimento monouso.
  NOTA: Il detersivo, come Tween 20, viene aggiunto per abbassare la tensione superficiale, consentendo al tessuto di affondare sul fondo del pozzetto.
3. Posizionare il piatto sul ghiaccio.
4. Raccogli le larve in pozzetti per piastre di dissezione riempiti con 1x PBS.
5. Posizionare un tampone di dissezione pulito su una base illuminata per stereomicroscopio. Utilizzare una pipetta di trasferimento monouso per posizionare piccole gocce di PBST allo 0,01% (Tabella 1) sul tampone. Trasferire una larva in una goccia PBST per la dissezione.
6. Tenere la larva con un paio di pinze a circa un quarto di lunghezza dall'estremità posteriore, con il lato dorsale rivolto verso l'alto.
7. Usa un altro paio di pinze per afferrare la cuticola immediatamente anteriormente al forcipe che tiene la larva. Tirare delicatamente la cuticola verso l'estremità anteriore fino a quando i ganci della bocca non sono esposti.
  NOTA: L'obiettivo è quello di sbucciare la cuticola senza disturbare le strutture interne.
8. Rilascia la cuticola e usa entrambe le pinze per tagliare la larva in due. Rimuovere l'estremità posteriore dal PBST drop.
  NOTA: Se la cuticola non si stacca fino ai ganci della bocca, taglia la larva in due e rimuovi l'estremità posteriore. Usa un paio di pinze per tenere il bordo della cuticola e usa l'altro paio di pinze per spingere i ganci della bocca attraverso l'apertura. Questo invertirà la cuticola ed esporrà i ganci della bocca. Questo può essere utilizzato anche come metodo di dissezione alternativo.
9. Usa un paio di pinze per bloccare la cuticola (la cuticola ventrale, il lembo della cuticola dorsale o entrambi) per stabilità.
10. Usa un altro paio di pinze per afferrare i ganci della bocca esposti ed estrarli delicatamente.
  NOTA: Questo separerà la cuticola dalle strutture interne. Idealmente, l'occhio/i dischi immaginali antennali, il cervello, la ghiandola anulare e la ghiandola linfatica che fiancheggiano il vaso dorsale rimarranno attaccati ai ganci della bocca.
11. Tenendo ancora i ganci per la bocca, rimuovere con cura le strutture indesiderate come le ghiandole salivari, il corpo grasso e l>'intestino<. NOTA: Se il cervello si separa dai ganci della bocca, la ghiandola linfatica potrebbe essere ancora attaccata e raccolta con il cervello. In questo caso, tieni il cordone nervoso ventrale invece dei ganci per la bocca.
12. Usando i ganci per la bocca o il cordone nervoso ventrale come maniglia, trasferire il complesso sezionato contenente la ghiandola linfatica nel pozzetto su ghiaccio. Non superare i 30 minuti prima del fissaggio.
Fissazione e immunoistochimica
1. Posizionare la piastra a 24 pozzetti sulla base dello stereomicroscopio.
2. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere con cura il PBST dal pozzetto.
  NOTA: I pozzi vuoti e limitrofi sono utili per depositare temporaneamente i rifiuti.
3. Aggiungere delicatamente 200 μl di formaldeide al 3,7% (Tabella 1) lungo il lato del pozzetto e agitare la piastra per assicurarsi che i tessuti sezionati siano completamente sommersi.
4. Rimettere la piastra in ghiaccio per 30 minuti. Se le ghiandole linfatiche esprimono proteine fluorescenti, tenere la piastra coperta per evitare il fotosbiancamento.
5. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere con cura il fissativo.
6. Lavare aggiungendo 200 μl 1x PBS al pozzetto e posizionando la piastra su un agitatore orbitale per 5 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere con cautela il PBS.
  NOTA: Le ghiandole linfatiche fisse possono essere lasciate sul ghiaccio nella PBS fino a quando le ghiandole linfatiche per tutte le condizioni sperimentali non vengono sezionate e fissate.
7. Ripetere le fasi di lavaggio altre due volte.
8. Aggiungere 200 μl di soluzione di permeabilizzazione (Tabella 1) al pozzetto. Posizionare la piastra su un agitatore orbitale per 45 minuti a RT.
  NOTA: 45 minuti è il "gold standard" per la permeabilizzazione delle ghiandole linfatiche, ma gli autori hanno successo dopo soli 20 minuti.
9. Rimuovere la soluzione con una pipetta p200.
10. Diluire l'anticorpo primario con la soluzione anticorpale (Tabella 1) secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere 300 μl di soluzione di anticorpi primari al pozzetto e assicurarsi che i tessuti sezionati siano completamente sommersi. Incubare a 4 °C per una notte.
11. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere l'anticorpo primario.
12. Lavare aggiungendo 200 μl di 1x PBS al pozzetto e posizionando la piastra su un agitatore orbitale per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere con cura il PBS.
13. Ripetere le fasi di lavaggio altre due volte.
14. Diluire l'anticorpo secondario con la soluzione anticorpale secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere 300 μl di soluzione di anticorpi secondari al pozzetto e assicurarsi che i tessuti sezionati siano completamente sommersi. Incubare su un agitatore orbitale per almeno 2 ore a RT.
15. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere l'anticorpo secondario e lavare come descritto nei passaggi 1.3.12 e 1.3.13. Non rimuovere il PBS dopo l'ultimo lavaggio.
Montaggio della ghiandola linfatica
1. Pulire i vetrini del microscopio utilizzando etanolo al 70% (Tabella 1) e salviette per tessuti.
2. Per ogni condizione sperimentale, posizionare una goccia di tampone di montaggio (Tabella 1) sul vetrino.
  NOTA: Due condizioni si adattano a una diapositiva. Il volume del tampone di montaggio dipende dal numero di ghiandole linfatiche da montare. Utilizzare 2 μl per circa 18-20 ghiandole linfatiche, 1 μl per 10-12 e 0,5 μl per 5 o meno.
3. Posizionare il vetrino del microscopio su una base illuminata dello stereomicroscopio.
4. Per un massimo di due condizioni alla volta, trasferire tutte le ghiandole linfatiche dal pozzetto al tampone di montaggio con una pinza, usando i ganci per la bocca o il cordone nervoso ventrale come maniglia.
5. Distanziare uniformemente i tessuti sezionati in una forma circolare o rettangolare, distribuendo il tampone di montaggio nel processo.
6. Per ciascuno dei tessuti sezionati, singolarmente, far scorrere una pinza sotto il vaso dorsale e tirare delicatamente verso la periferia del tampone di montaggio.
  NOTA: Questo estrarrà la ghiandola linfatica dal resto dei tessuti sezionati e appiattirà la ghiandola linfatica sul vetro.
7. Usando una pinza e un movimento di segatura, taglia il vaso dorsale tra la ghiandola linfatica e il cervello.
8. Spostare il resto dei tessuti sezionati sul lato opposto della ghiandola linfatica, all'estremità esterna del tampone.
  NOTA: I tessuti sezionati indesiderati alla fine formeranno un perimetro attorno alle ghiandole linfatiche e serviranno come supporto su cui poggerà il vetrino.
9. Ripetere fino a quando tutte le ghiandole linfatiche sono separate dai tessuti sezionati, riservando uno dei tessuti sezionati indesiderati da posizionare al centro.
10. Prendi un vetrino coprioggetti tra due dita. Verificare che il vetrino coprioggetti sia privo di polvere e impronte digitali. Se necessario, utilizzare un panno di carta e etanolo al 70% per pulire il vetrino coprioggetti.
11. Assicurandosi che il bordo del vetrino coprioggetti sia parallelo al bordo del vetrino, abbassare con cautela il vetrino coprioggetti sul tampone di montaggio.
  NOTA: I vetrini del microscopio possono essere conservati a 4 °C prima dell'imaging. Il tempo massimo di conservazione dipende dalla stabilità degli anticorpi utilizzati. Le piastre a 24 pozzetti possono essere risciacquate e riutilizzate.

2. Imaging

Immagine di emociti fissati e ghiandole linfatiche montate su un microscopio a fluorescenza standard o confocale appropriato con un ingrandimento di 20X o superiore secondo il manuale operativo del produttore. Immagine di larve intere su uno stereomicroscopio standard con ingrandimento 2X secondo il manuale operativo del produttore.
Se lo si desidera, seguire le istruzioni del fornitore del software per la deconvoluzione.

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Risultati

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Figura 1: Melanizzazione delle cellule cristalline in vivo. A) Le larve sono state poste singolarmente in provette per PCR prima del riscaldamento. Le frecce rosse indicano le larve che non si trovano sul fondo dei tubi. B) Un tipico pattern di melanizzazione delle cellule cristalline dopo il riscaldamento, che a volte rivela la ghiandola linfatica (freccia; lato dorsale mostrat...